白介素—10对去卵巢小鼠骨质疏松的作用

严正杰++戴有金++侯道荣

[摘要] 目的 探討白介素-10（IL-10）对去卵巢小鼠骨质疏松的影响。 方法 采用随机数表法将60只ICR小鼠随机分为对照组、模型组（OVX组）和治疗组（IL-10组），每组20只。OVX组小鼠切除双侧卵巢复制骨质疏松动物模型；IL-10组小鼠切除双侧卵巢后尾静脉注射IL-10（80 mg/kg），2次/周，连续给药12周；对照组只切除卵巢周围与卵巢大小相当的一块脂肪组织。12周后检测各组小鼠骨相关参数以及血清骨源性碱性磷酸酶（BALP）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。 结果 OVX组小鼠造模后，骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）明显下降，骨小梁分离度（Tb.Sp）显著上升，与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。OVX组小鼠呈现明显的骨质疏松表现。而与OVX组比较，IL-10治疗组小鼠BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th明显上升，Tb.Sp明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。Micro-CT分析图像显示，OVX组小鼠骨小梁显著减少，而IL-10治疗组小鼠股骨远端骨小梁减少程度有明显改善。与对照组比较，OVX组小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显增高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；而同时给予IL-10治疗后，小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显下降，与OVX组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 IL-10能够增加去卵巢骨质疏松症小鼠BMD，降低BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平，减轻骨质疏松症状。IL-10在去卵巢小鼠骨质疏松的治疗上有明显作用。

[关键词] 白介素-10；骨质疏松；骨密度；白介素-1β；白介素-6；肿瘤坏死因子-α

[中图分类号] R681 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（a）-0039-05

[Abstract] Objective To explore the effect of interleukin-10 （IL-10） on osteoporosis in ovariectomized mice. Methods 60 ICR mice were divided into three groups： control group， model group （OVX group） and treatment group （IL-10 group） by using random data table， each group had 20 mice. Bilateral ovaries in mice of OVX group were removed to establish ovariectomized mice model. Bilateral ovaries in mice of IL-10 group were removed， followed by IL-10 injection （80 mg/kg） for 12 weeks in a row （2 times per week）. Only a piece of fat tissue size same as ovary around the ovary was removed in the control group. After 12 weeks， bone related parameters， bone alkaline phosphatase （BALP）， IL-1β， IL-6 and tumor necrosis factor （TNF）-α of the bone tissue were measured. Results Compared with control group， bone mineral density （BMD）， bone volume fraction （BV/TV）， trabecular thickness （Tb.Th） and trabecular number （Tb.N） significantly decreased， and trabecular separation （Tb.Sp） increased in OVX group， with statistically significant differences （P < 0.01）. The OVX group animals had obvious performance of osteoporosis. After IL-10 treatment， compared with OVX group， BMD， BV/TV， Tb.Th and Tb.N significantly increased， and Tb.Sp decreased， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Micro-CT images showed that trabecular number in OVX group decreased obviously， and increased significantly in IL-10 group. Compared with control group， serum BALP， IL-1β， IL-6 and TNF-α significantly increased in OVX group （P < 0.01）； after IL-10 treatment， serum BALP， IL-1β， IL-6 and TNF-α decreased obviously in IL-10 group， compared with OVX group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion IL-10 can alleviate the symptoms of osteoporosis， increase the BMD and decrease levels of BALP， IL-1β， IL-6 and TNF-α in serum. IL-10 has an apparent role of anti-osteoporosis in ovariectomized mice.

[Key words] IL-10； Osteoporosis； BMD； IL-1β； IL-6； TNF-α

骨质疏松症是一种以骨组织微观结构退化和骨量减少为特点，导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病[1]，其被视为继心血管病之后的第二大致死性健康问题[2]。随着我国人口老龄化的日趋严重，骨质疏松症的发病率逐年升高。骨质疏松症的发病率女性高于男性，其发生与雌激素有关[3]。尤其对于绝经期妇女，绝经后雌激素的分泌不足会导致骨质疏松，60岁时约有15%的妇女会发生骨质疏松，80岁时则增加到38%[4]。IL-10（interleukin-10）是一种重要的免疫调节因子，具有较强的抗炎作用[5-6]。有研究表明，IL-10对破骨细胞的重聚和活化有抑制作用[7]，并且对骨吸收有保护作用[8]。本文拟对IL-10对小鼠骨质疏松症的治疗作用做初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性ICR小鼠60只，体重为（22±2）g，购自南京医科大学医药实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK （苏）2016-0002。动物自由饮食并置于恒定环境[温度（22±2）℃，湿度（50±5）%，12 h昼/夜循环光照]下饲养。

1.2 主要药品与仪器

小鼠IL-10（210-10），美国PEPRO？鄄TECH公司；Micro-CT（Skyscan 1176），德国BRUKE公司；骨源性碱性磷酸酶试剂盒（BALP，H234）、IL-1β检测试剂盒（H002）、IL-6检测试剂盒（H007）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒（H052），南京建成生物工程研究所。

1.3 动物分组及处理

60只ICR小鼠采用随机数字表法分为对照组、骨质疏松模型组（OVX组）和治疗组（IL-10组），每组20只。OVX组和IL-10组小鼠行双侧卵巢切除术。以1%戊巴比妥钠50 mg/kg剂量腹腔注射麻醉后，小鼠采用俯卧位。无菌条件下腹部背侧（脊柱两侧）各做0.5～1 cm的纵行切口，使用无菌镊子拉出双侧卵巢并摘除，止血后放回腹腔并分两层缝合切口，术后给予青霉素预防感染。对照组只切除卵巢周围与卵巢大小相当的一块脂肪组织[9]。造模后，IL-10组小鼠尾静脉注射IL-10（80 mg/kg），2次/周，连续给药12周。三组小鼠饲养条件一致，自由摄食进水，实验时间为12周。12周后各组小鼠取样用于检测。

1.4 股骨取材

动物处死后，立即无菌操作取右侧股骨，迅速放入4%多聚甲醛中4℃固定24 h后置入PBS中保存。

1.5 Micro-CT检测

取各组小鼠右侧股骨用于CT扫描。扫描条件：分辨率为18 μm，滤片为0.5 mm Al，旋转步径为0.6°。使用BRUKE公司CTan软件分析骨相关参数。

1.6 血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平測定

使用酶联免疫试剂盒检测各组小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

采用SPSS 11.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨相关参数测定

小鼠骨质疏松造模后，因为感染死亡6只。各组动物饲养12周后，选取16只用于数据分析。小鼠股骨远端骨相关参数分析结果显示，OVX组小鼠造模后，骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）明显下降，骨小梁分离度（Tb.Sp）显著上升，与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。而与OVX组比较，IL-10组小鼠BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th明显升高，Tb.Sp明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。各组小鼠股骨远端冠状面和矢状面图像也显示OVX组小鼠骨小梁显著减少，而IL-10组小鼠股骨远端骨小梁减少程度有明显改善。见图1。

2.2 血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平测定

血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平测定结果表明，OVX组小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显增高，与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；而同时给予IL-10治疗12周后，小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显下降，与OVX组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

3 讨论

Saville首次建立的去卵巢型骨质疏松动物模型主要代表原发性骨质疏松症中的Ⅰ型[10]，该模型成功模拟了绝经后骨质疏松症骨代谢特点[11]，因而得到了广泛应用。近年来，随着对骨质疏松症病因病理研究的深入，细胞因子在其中发挥的作用越来越受到重视。骨质疏松的致病机制尚未明确，但近年来随着发病机制的深入研究，发现细胞因子与骨质疏松的联系越来越紧密[12-13]。

血清BALP是最常用的评价骨形成和骨转换的指标，可反映成骨细胞活性。越来越多的研究表明，血清BALP检测可作为骨形成的特异性生化指标[14]。BALP是成骨细胞分泌的一种胞外酶，为多糖蛋白，它在细胞内合成，在多糖-肌醇磷酸特异水解酶作用下，BALP被释放到血循环中发挥作用。BALP的主要功能是在成骨过程中水解磷酸酯，为羟基磷灰石的沉积提供必须的磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，有利于骨形成[15]。本研究显示，OVX组小鼠BALP显著升高，提示反映骨形成的生化指标BALP在骨质疏松发病活动期有显著增高。而IL-10治疗后抑制了骨质疏松的程度，也抑制了BALP的活性。

IL-1是一类影响各种细胞因子的低分子蛋白，主要由中性粒细胞、单核-巨噬细胞分泌，分为IL-1α和IL-1β两种，两者均具有促进骨吸收的作用[16]，其中，IL-1β是较强的刺激骨吸收的因子之一[17]。IL-1β还可作为“上游因子”刺激“下游因子”如M-CSF、TNF-α和IL-6等表达，间接激活破骨细胞，并抑制其凋亡，加速骨吸收进程[18]。IL-1β还可以促进破骨细胞黏附于钙化的骨小梁的表面，从而加速骨吸收[19]。本研究表明，OVX组小鼠IL-1β较对照组显著升高，提示破骨活动增强。而IL-10治疗后使IL-1β水平明显下降，说明IL-10对IL-1β的破骨作用有抑制作用。已有研究证实，IL-10可通过抑制炎症因子IL-1β的产生进而减弱破骨细胞的作用，从而抑制骨吸收和骨量流失[17]。

IL-6是一种具有多功能的生物活性因子，在骨微环境中，多种活性细胞可以产生IL-6，如活性T细胞、B细胞、单核细胞、间质细胞和破骨细胞。有研究发现，血清IL-6随年龄增长而增加，血清IL-6和BMD存在负相关关系，并且IL-6和骨丢失存在着密切的关系[20]。Poli等[21]报道IL-6基因敲除小鼠卵巢切除后BMD和骨转换率都不发生改变，证明IL-6在骨质疏松的发病机制中起关键作用。临床研究表明，正常人血中IL-6含量低，随年龄的增加IL-6含量升高，女性绝经后血中IL-6明显升高，IL-6 mRNA在骨质疏松患者骨组织中的表达明显高于正常女性[22]。绝经后雌激素缺乏所出现的骨质疏松，部分是由于雌激素对IL-6的抑制减弱，导致骨吸收增加引起的。IL-6的主要破骨作用是诱导破骨细胞生成和破骨细胞活化，可以直接加强破骨细胞的活性，抑制其凋亡[23]。另一方面，IL-6还可通过NF-κB加強细胞的破骨能力[24]。本研究中OVX组IL-6较对照组显著升高（P < 0.01），表明去卵巢后雌激素水平骤降，对IL-6的抑制作用减弱，导致血清IL-6增高；IL-10组IL-6较OVX组显著降低（P < 0.01），说明IL-10对IL-6水平有抑制作用，从而减少了骨吸收。

TNF-α是由单核-巨噬细胞、内皮细胞及淋巴细胞等产生的细胞因子，具有广泛的生物活性，可以加速骨吸收，促进骨相关细胞凋亡，同时还可以增强破骨细胞的增殖和分化，影响骨吸收[25-33]。本研究中，OVX组TNF-α较对照组显著升高（P < 0.01）；IL-10组TNF-α较OVX组则显著降低（P < 0.05）。原因很可能是由于IL-1β、IL-6诱导破骨细胞活性增强，骨破坏所释放的产物激活巨噬细胞，从而产生更多的TNF-α；当IL-1β、IL-6被抑制后，TNF-α水平相应减少。

综上所述，IL-10对IL-1β、IL-6以及TNF-α有明显的抑制作用，使破骨细胞的破骨作用下降，从而使骨重吸收减少，抑制了骨质疏松的严重程度，这对临床上治疗绝经后骨质疏松提供了实验基础，但其具体的作用机制还有待进一步研究。

[参考文献]

[1] Fonseca H，Moreira-Goncalves D，Coriolano HJA，et al. Bone quality： the determinants of bone strength and fragility [J]. Sports Medcine，2014，44（1）：1-17.

[2] 李素萍.骨质疏松动物模型的研究现状[J].中国组织工程研究，2011，15（20）：3767-3770.

[3] Black DM，Thompson DE. The effect of alendronate therapy on osteoporotic fracture in the vertebral fracture arm of the Fracture Intervention Trail [J]. International Journal of Clinical Practice Supplement，1999，101（101）：46-50.

[4] 李亚东.骨质疏松症[J].中国临床医生，2004，32（11）：25-27.

[5] Mumm JBJ，Emmerich JJ，Zhang XX，et al. IL-10 elicits IFN-dependent tumour immune surveillance [J]. Cancer Cell，2011，20（3）：781-796.

[6] Franz M，Doll F，Grun K，et al. Targeted delivery of inter？鄄leukin-10 to chronic cardiac allograft rejection using a human antibody specific to the extra domain a of fibro？鄄nectin [J]. International Journal of Cardiology，2015，195：311-322.

[7] 覃淑云，蔡科军，冯照善，等.骨质疏松大鼠成骨细胞雌激素受体与颅骨IL-10表达的相关性研究[J].广西医学，2011，33（11）：1393-1396.

[8] 赵莹，庞宇轩，敦欣卉，等.白细胞介素-10对骨质疏松小鼠牙槽骨吸收的保护作用[J].中国老年学杂志，2016， 36（11）：2580-2582.

[9] Ozmen B，Kirmaz C，Aydin K，et al. Influence of the selective oestrogen receptor modulator（raloxifene hydrochloride）on IL-6，TNF-alpha，TGF-beta1 and bone turnover markers in the treatment of postmenopausal osteoporosis [J]. Euro？鄄pean Cytokine Network，2007，18（3）：148-153.

[10] Saville PD. Changes in skeletal mass and fragility with castration in the rat：a model of osteoporosis [J]. Journal of the American Geriatrics Society，1969，17（2）：155-162.

[11] 王冰，徐又佳，郝彦明，等.去卵巢和激素致骨质疏松模型中骨密度与血清指标的比较[J].苏州大学学报：医学版，2008，28（1）：10-13.

[12] Ostrowska Z，Ziora K，Owicimska J，et al. Selected pro-inflammatory cytokines，bone metabolism，osteoprotegerin，and receptor activator of nuclear factor-κB ligand in girls with anorexia nervosa [J]. Endokrynologia Polska，2015， 66（4）：313-321.

[13] Aldaghri NM，Yakout S，Alshehri E，et al. Inflammatory and bone turnover markers in relation to PTH and vitamin D status among saudi postmenopausal women with and without osteoporosis [J]. International Journal of Clinical & Experimental Medicine，2014，7（9）：2812-2819.

[14] Magnusson P，Larsson L，Englund G，et al. Difference of bone alkaline phosphtastatic bone disease and discrepant effects of clodronate on different skeletal sits indicated by the location of pain [J]. Clinical Chemistry，1998，44（1）：1621-1628.

[15] 吴文苑.骨型碱性磷酸酶的检测方法和临床应用[J].国际检验医学杂志，1999，20（2）：64-65.

[16] Rahnama M，Jastrzbska I，Jamrogiewicz R，et al. IL-1α and IL-1β levels in blood serum and saliva of meno？鄄pausal women [J]. Endocrine Research，2013，38（2）：69-76.

[17] 吴迎爽.吡格列酮对去卵巢大鼠IL-1β、IL-6、TNF-a的影响及与骨代谢关系的实验研究[J].中国骨质疏松杂志，2015，6（2）：152-157.

[18] Yu H. FTY720 inhibited proinflammatory cytokine release and osteoclastogenesis induced by Aggregatibacter act？鄄inomycetemcomitans [J]. Lipids in Health & Disease，2015， 14（1）：1-11.

[19] Thongchote K，Svasti S，Teerapornpuntakit J，et al. Running exercise alleviates trabecular bone loss and osteopenia in hemizygous β-globin knockout thalassemic mice [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2014，306（12）：1406-1417.

[20] 方秀统，李洋，于方，等.白细胞介素-6在老年骨质疏松发病机制中的作用[J].中国老年学杂志，2014，32（24）：6917-6918.

[21] Poli V，Balena R，Fattori E，et al. Interleukin-6 deficient mice are protected from bone loss caused by estrogen depletion [J]. Embo Journal，1994，13（5）：1189-1196.

[22] KokaS，Petro TM，Reinhardt RA. Estrogen Inhibits Interl？鄄eukinlβ-Induced Interleukin-6 Production by Human Osteoblast-like Cells [J]. Journal of Interferon & Cyto？鄄kine Research，1998，18（7）：479-483.

[23] Xu JJ，Wang YL. Propofol attenuation of hydrogen per？鄄oxide-mediated oxidative stress and apoptosis in cul？鄄tured cardiomyocytes involves haeme oxygenase-1 [J]. Eur？鄄opean Journal of Anaesthesiology，2008，25（5）：395-402.

[24] 倪新莉，呂金捍，廖红.新生猪缺氧缺血性脑病模型的建立[J].中华实验外科杂志，2009，26（11）：1560-1562.

[25] Qian H，Yuan H，Wang J，et al. A monoclonal antibody ameliorates local inflammation and osteoporosis by targ？鄄eting TNF-α and RANK [J]. International Immunoph？鄄armacology，2014，20（2）：370-376.

[26] 张志勇，孙晓威，张金辉，等.不同治疗方式对老年骨质疏松性脊柱压缩骨折患者腰背部疼痛的疗效观察[J].中国医药，2015，10（3）：399-401.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4777.2015.03.031.

[27] 何美庆，柯亭羽.艾滋病与骨质疏松相关性的研究进展[J].中国医药科学，2016，6（8）：34-37.

[28] 莫文秋.骨质疏松动物模型评价方法的研究进展[J].医学综述，2016，22（7）：1330-1332.DOI：10.3969/j.issn.1006-2084.2016.07.024.

[29] 马丹军，王征，任洪丽，等.阿仑膦酸钠治疗绝经后糖尿病性骨质疏松的疗效及对动脉硬化的影响[J].疑难病杂志，2015，14（7）：705-707，711.DOI：10.3969/j.issn.1671-6450.2015.07.014.

[30] 黎濤.雌激素联合抗骨质疏松药物治疗绝经后妇女骨质疏松症75例临床疗效分析[J].中国医药科学，2015，5（24）：54-56.

[31] 耿雨，周玉杰，刘宇扬，等.骨质疏松与冠状动脉病变严重程度的相关性研究[J].中国医药，2016，11（11）：1585-1588.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4777.2016.11.001.

[32] 周晓，孙伟，隋晓杰，等.糖皮质激素引发骨质疏松或骨坏死等不良反应研究进展[J].疑难病杂志，2015，14（5）：534-540.DOI：10.3969/j.issn.1671-6450.2015.05.030.

[33] 孙玉敏，李媛.中药防治骨质疏松的研究进展[J].医学综述，2016，22（17）：3448-3450，3454.DOI：10.3969/j.issn.1006-2084.2016.17.033.

（收稿日期：2016-12-15 本文编辑：程 铭）