膀胱移行细胞癌组组织Bcl-2的表达及与临床生物学行为的关系

杨立军 郑文武 周安传 苏晓哲 吴亚东 李珅

·论著·

膀胱移行细胞癌组组织Bcl-2的表达及与临床生物学行为的关系

杨立军 郑文武 周安传 苏晓哲 吴亚东 李珅

目的 探讨Bcl-2在膀胱移行细胞癌及癌旁组织中的蛋白表达水平，分析其与临床病理指标的关系及意义，为膀胱移行细胞癌的诊断及临床治疗提供理论依据。方法 用流式细胞分析技术检测45例膀胱移行细胞癌及对应的45例癌旁组织及10例正常膀胱黏膜移行上皮组织中的Bcl-2蛋白的表达。结果 癌旁组织组Bcl-2阳性率高于正常膀胱组和膀胱移行细胞癌组，膀胱移行细胞癌组表达阳性率高于正常膀胱组，差异均有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2表达与膀胱移行细胞癌的组织学分级关系密切(P<0.05)，而与患者性别、年龄、淋巴转移情况及肿瘤临床分期等均无相关性(P>0.05)。膀胱移行细胞癌组织Bcl-2蛋白表达阳性的凋亡率明显低于阴性表达(P<0.05)。结论Bcl-2在正常膀胱组织中低表达。Bcl-2随着膀胱癌病理分级的增加阳性率逐渐增加，在膀胱移行细胞癌中，Bcl-2发挥重要作用，与膀胱移行细胞癌的生物学行为密切相关。

Bcl-2:膀胱移行细胞癌：癌旁：蛋白表达：流式细胞分析技术

研究发现，细胞增殖和凋亡因子失衡是肿瘤发生的关键因素，其受到内源性(遗传、免疫、种族、内分泌等)和外源性因素(化学、物理、生物等)的影响[1]。凋亡抑制蛋白(IAP)是一类内源性抑制因子，其主要通过Caspases蛋白酶激活级联反应途径和肿瘤坏死因子受体介导的信号转导途径抑制细胞凋亡，其高表达引起凋亡不足，与肿瘤发生关系密切。Bcl-2蛋白是一种具有抑制细胞凋亡的作用蛋白，其通过细胞抗氧化作用、抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质、抑制促凋亡的Bax/Bak细胞毒作用等通路发挥抑制细胞凋亡。本文用流式细胞分析技术研究Bcl-2在膀胱移行细胞癌、癌旁组织中的蛋白表达水平，分析其与临床生物学行为的关系及意义，为膀胱移行细胞癌的诊断及临床治疗提供理论方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本取自2012至2013年在石家庄市第一医院泌尿外科进行外科治疗的住院患者，其中膀胱移行细胞癌45例(膀胱移行细胞癌组)、对应的癌旁组织45例(癌旁组织组)，正常膀胱黏膜组织10例(正常膀胱组)。膀胱移行细胞癌组均经术后病理证实，其中男33例，女12例；年龄26～68岁，平均年龄(50±10)岁；按照WHO病理分级：G1 12例，G2 20例，G3 13例；TNM临床分期诊断标准：非浸润性癌(Ta-1期)19例，浸润性癌(T2～4期)26例;单发24例，多发21例；初发29例，复发16例；正常膀胱组患者10例均为前列腺增生症、膀胱结石的膀胱黏膜组织且经病理证实，其中男7例，女3例；年龄27～69岁，平均年龄(51±9)岁。上述标本经4%多聚甲醛固定。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：兔抗人Bcl-2多克隆抗体：SantaCruz公司；hanks(缓冲液)：百浩生物科技有限公司；AlexaFiuor488(异硫氰酸荧光素)：Proteintech公司：胃蛋白酶工作液：上海易欣生物科技有限公司

1.2.2 仪器：BDFACSEALIBUR流式细胞仪BDBioscience公司(U.S.A)

1.3 试验方法 应用流式细胞分析技术检测。

1.4 试验步骤 在检测蛋白免疫荧光标记物时，设hanks(缓冲液)为阴性对照，二抗AlexaFiuor488(异硫氰酸荧光素)为阳性对照。具体操作步骤如下：

1.4.1 标本蜡块的处理：在切片机上将蜡块包埋的组织切取3～5片40～50μm厚的组织片。

1.4.2 脱蜡：将切取的组织片放入试管中，用二甲苯5～8ml(室温)浸泡2～3d，其间更换1次或2次二甲苯，脱净石蜡。

1.4.3 水化：依次用100%、95%、70%、50%浓度的乙醇6～8ml对组织进行水化，每次水化10～15min，弃掉乙醇。加入0.9%氯化钠溶液5～8ml浸泡30min，弃掉0.9%氯化钠溶液。

1.4.4 消化：经水化的组织加入0.5%胃蛋白酶(pH值1.5～2.0)2ml，置37℃恒温水浴中，每10分钟振荡1次。30min后，立即加入0.9%氯化钠溶液终止消化。

1.4.5 过滤：将消化好的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织，边搓边用0.9%氯化钠溶液冲洗，直至将组织搓完。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去掉细胞团块。

1.4.6 离心：将收集的细胞悬液离心沉淀1 500r/min，4min，去掉多余悬清液，以0.9%氯化钠溶液漂洗1次，离心沉淀1 000r/min，4min，去掉多余悬清液，再以0.9%氯化钠溶液漂洗1次，再离心沉淀800r/min，4min，去掉多余悬清液，剩约0.5ml。

1.4.7 标抗：将Bcl-2一抗按1∶50进行稀释。离心后的组织加入Bcl-2抗体工作液0.1ml，静置1h，加入hanks(0.01mol/L)5～8ml，离心沉淀800r/min，4min，弃悬清液，再加入二抗(AlexaFiuor488)100μl，2h后，加入hanks5～8ml，离心同上，除去未结合的荧光二抗，上机检测。

1.5 结果评定标准Bcl-2蛋白表达含量以细胞的平均荧光强度表示，为了使免疫荧光定量分析更加完备，将平均荧光强度换算成荧光指数(FI)，用FI来表示Bcl-2在组织中的相对表达含量，按照组织细胞表达荧光指数大小对其进行统计分类，FI≤1判定表达量为阴性，FI>1判定为阳性。应用流式细胞仪检测Bcl-2阳性和阴性表达细胞的凋亡率。

2 结果

2.1 3组Bcl-2蛋白在膀胱组织中的表达比较Bcl-2在正常膀胱组、膀胱移行细胞癌组、癌旁组织组的阳性表达率为10.00%、51.11%、73.33%，癌旁组织组Bcl-2阳性率高于正常膀胱组和膀胱移行细胞癌组，膀胱移行细胞癌组表达阳性率高于正常膀胱组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组Bcl-2表达阳性率比较 例

注：与正常膀胱组比较，*P<0.05；与膀胱移行细胞癌组比较，#P<0.05

2.2 膀胱移行细胞癌组Bcl-2表达阳性率与临床病理特征的关系Bcl-2表达与膀胱移行细胞癌的组织学分级初发、复发情况关系密切(P<0.05)，而与患者性别、年龄、淋巴转移情况及肿瘤临床分期等均无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 膀胱移行细胞癌组Bcl-2表达阳性率与临床病理特征的关系 n=45，例(%)

注:与G1比较，*P<0.05；与G2比较，#P<0.05；与初发比较，△P<0.05

2.2Bcl-2蛋白表达与凋亡率的关系 膀胱移行细胞癌组织Bcl-2蛋白表达阳性的凋亡率明显低于阴性表达(P<0.05)。见表3。

组别凋亡率t值P值阳性(n=23)4．29±0．6716．3410．000阴性(n=22)8．85±1．15

3 讨论

研究表明，细胞凋亡过程中线粒体是具有重要作用的超微结构，凋亡过程中线粒体通透性转换孔、跨膜电位变化、细胞色素C等均依赖于线粒体[2]。线粒体膜上Bcl-2家族蛋白可以调节线粒体内外膜的渗透性改变线粒体形态，细胞色素C释放，进一步与其他物质组装成凋亡小体，激活caspase9、caspase3，引起caspases级联激活反应导致细胞凋亡,或直接作用于细胞核引起细胞凋亡。由此可见,线粒体除了具有经典的生物学效应外,还具有调控细胞存亡的重要作用[1]。

Bcl-2基因是一种原癌基因，研究发现许多基因结构与Bcl-2相似，参与细胞凋亡的调解，因此将这些基因统称为Bcl-2基因家族。Bcl-2基因是t(14∶18)染色体异位断点处发现的一种癌基因。Bcl-2家族迄今为止发现的Bcl-2家族同源蛋白不少于15种,均含有一种以上Bcl-2家族共有同源序列(BH1-BH4)。Bcl-2蛋白家族是一组和Bcl-2蛋白在氨基酸序列和(或)蛋白质空间结构上具有有同源性的蛋白质，根据功能可以分为两类：抗凋亡和促凋亡蛋白。Bcl-2家族中抑制凋亡因子与促进凋亡因子的比例决定细胞的命运。Bcl-2蛋白家族按结构可以分为三类：(1)前凋亡蛋白：BH3-only蛋白，具有共同的基序，称为BH3结构域，它感应不同的信号启动细胞凋亡。BH3-only蛋白已被进一步分为“增敏剂/诱导剂”，如Noxa,Bfm或Bik，可抗凋亡Bcl-2蛋白作用并中和它的抗凋亡功能，和“直接激活剂”，如Bid和Bim，它们有能力直接激活促凋亡Bcl-2蛋白BaxandBak,多数抗凋亡蛋白含BH1和BH2区,与Bcl-2高度同源的含1～4四个区[2]。(2)促凋亡蛋白Bax和Bak，含结构域BH1、BH2、BH3；它们直接参与MOM穿孔反应。(3)抗凋亡Bcl-2蛋白，含结构域BH1、BH2、BH3、BH4如Bcl-2，bclxl，中，Mcl-1和A1，通过直接与促凋亡成员作用抑制细胞死亡。前凋亡蛋白之间、抗凋亡蛋白之间及这两类蛋白之间可相互作用形成同源或异二聚体,形成一个复杂的调控网络,前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的相对比值在决定细胞生存抑或死亡中可能起关键作用。

Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白之一，位于线粒体内膜、核膜和内质网，分子量为26 000，它是人类滤泡状淋巴瘤的细胞遗传学标志。目前，关于Bcl-2抑制细胞凋亡的研究很多，Bcl-2的高表达可保护各种凋亡刺激，因此Bcl-2低表达或缺失的细胞死亡率明显增加。

Bcl-2蛋白家族对细胞凋亡的调控作用：(1)Bcl-2家族对线粒体通路的凋控，该通路的线粒体渗透性改变形成的PT孔 (permeabilitytransitionpore)开放和线粒体内致凋亡的多种蛋白释放均受Bcl-2家族凋控。Bcl-2或其他抗凋亡蛋白过表达使许多本可致PT孔开放、细胞色素C及凋亡诱导因子 (apoptosisinducingfactor,AIF)释放的刺激失效，从而抑制细胞凋亡;而前凋亡蛋白Bax过表达导致线粒体跨膜电位丢失及细胞色素C释放导致细胞凋亡[3]。Shimizu等[4]发现重组前凋亡蛋白Bax和Bak能加速电压依赖的阴离子通道(voltagedependentanionchannel,VDAC)开放,而Bcl-XL则通过直接与之结合关闭VDAC,提示Bcl家族蛋白可通过VDAC调节线粒体膜的通透性,影响膜电位及细胞色素C释放,从而促进或抑制凋亡[4]。(2)Bcl-2家族对内质网通路的凋控，研究表明，胞质中较高的钙浓度，可导致线粒体PT孔道的形成和母体的膨胀。结果，线粒体外膜破裂，膜间隙中的促凋亡蛋白流入细胞质，促进细胞凋亡[4]。钙浓度变化在内质网通路中是很关键的凋亡信号,Bcl-2家族除存在于线粒体膜表面外,也存在于内质网膜,能阻断多种致使内质网释放储存钙的凋亡刺激。Foyouzi等[5]发现Bcl-2的通过增加内质网膜对钙离子通透性而减少内质网内可释放的游离钙离子浓度。(3)Bcl-2家族对死亡受体通路的凋控，死亡受体通路通过Fas,TNFR激活Caspase8直接激活Caspase3引起凋亡,主要存在于线粒体表面的Bcl-2应该对此通路无影响。但在另一些情况下Bcl-2可抑制死亡受体通路诱发的凋亡。

国内王养民等[6]报道:取应用免疫组化技术检测57例经病理证实的膀胱肿瘤的Bcl-2的表达。结果显示正常膀胱黏膜中无表达，膀胱移行细胞癌Ⅰ级15例,阳性率13.3%;Ⅱ级16例,阳性率6.2%;Ⅲ级18例,阳性率50.0%。膀胱横纹肌肉瘤阳性1例,葡萄状肉瘤阳性1例,内胚窦瘤阳性1例。从而得出结论:凋亡抑制基因Bcl-2蛋白在移行细胞癌及其他细胞类型的膀胱癌中有表达,如膀胱横纹肌肉瘤、葡萄状肉瘤及内胚窦瘤；而在Ⅲ级移行细胞癌中表达阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ级肿瘤,说明Bcl-2蛋白的表达与膀胱肿瘤的分级有一定关联；但Bcl-2蛋白的表达能否作为膀胱肿瘤标志物及与膀胱肿瘤患者存活有否关系仍需进一步深入的研究。Shiina等[7]用免疫组化的方法,结果发现Bcl-2 在膀胱移行细胞癌中表达为24.7%,在癌旁移行上皮中为96.1%。国内康元上等[8]在膀胱膀胱癌及癌旁组织p53、Bcl-2表达的初步研究的结果显示：肿瘤上皮中表达为31.1%,而在癌旁组织中为53.3%～75.5%。说明Bcl-2在表浅性BTCC及癌旁组织的基底及基底下层高表达。癌组织与癌旁组织Bcl-2的表达差异有统计学意义(P<0.01)。国内罗旭等[9]报道，Bcl-2在非浸润性膀胱癌的阳性率低于浸润性膀胱癌的阳性率，但相互间差异无统计学意义(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表达与膀胱癌的临床分期无关。Bcl-2在复发性膀胱癌的阳性率高于初发性膀胱癌的阳性率，相互间差异有统计学意义(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表达与膀胱癌的复发有关，可作为膀胱癌术后预测肿瘤复发的监测指标之一。国内习小庆等[10]报告的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级膀胱癌的阳性率分别为18.8%、52.0%和60.0%,表明其表达与癌组织的恶性程度有相关关系。有文献报道,在子宫内膜增生、胃肠上皮发育异常、皮肤组织病中Bcl-2表达明显增高,在前列腺、胃肠道癌旁组织中Bcl-2的表达亦明显增高[11-13]。癌旁组织Bcl-2表达的增高,说明Bcl-2基因可能是肿瘤发生与进展的早期。

Bcl-2在正常膀胱黏膜中低表达,在移行细胞癌及其他细胞类型的膀胱癌如膀胱横纹肌肉瘤、葡萄状肉瘤及内胚窦瘤中有表达，在Ⅲ级移行细胞癌中表达阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ级肿瘤,说明Bcl-2蛋白的表达与膀胱肿瘤的分级有关联。Bcl-2在非浸润性膀胱癌的阳性率低于浸润性膀胱癌的阳性率，但相互间差异无统计学意义(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表达与膀胱癌的临床分期无关。Bcl-2在复发性膀胱癌的阳性率高于初发性膀胱癌的阳性率，相互间差异有统计学意义(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表达与膀胱癌的复发有关，可作为膀胱癌术后预测肿瘤复发的参考指标之一。但Bcl-2蛋白的表达能否作为膀胱肿瘤标志物及与膀胱肿瘤患者的存活率是否有关系仍需进一步深入的研究。

本试验Bcl-2在正常膀胱黏膜中低表达,在膀胱移行细胞癌及癌旁细胞中高表达，在Ⅲ级移行细胞癌中表达阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ级肿瘤,Ⅰ级与Ⅲ级，Ⅱ级与Ⅲ级相互间差异显著(P<0.05)，说明Bcl-2蛋白的表达与膀胱肿瘤的分级有一定关联，随着膀胱癌恶性程度的增加Bcl-2蛋白的表达亦增加。Bcl-2在非浸润性膀胱癌的阳性率低于浸润性膀胱癌的阳性率，但相互间差异无统计学意义(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表达与膀胱癌的临床分期无关。Bcl-2在复发性膀胱癌的阳性率高于初发性膀胱癌的阳性率，相互间差异有统计学意义(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表达与膀胱癌的复发有关，可作为膀胱癌术后预测肿瘤复发的参考指标之一。但Bcl-2蛋白的表达能否作为膀胱肿瘤标志物及与膀胱肿瘤患者的存活率是否有关系仍需进一步深入的研究。本研究结果也显示Bcl-2表达阳性的凋亡率明显低于阴性表达，即Bcl-2表达与凋亡率呈负相关，表明Bcl-2参与BTCC的凋亡机制。本实验研究表明在膀胱移行细胞癌Bcl-2的表达随着膀胱肿瘤的分化程度越差阳性表达就增加，呈现正相关(P<0.05)。

综上所述，在膀胱移行细胞癌中，Bcl-2发挥重要作用，与膀胱移行细胞癌的生物学行为密切相关，深入研究Bcl-2在膀胱移行细胞癌中的蛋白表达及与其生物学行为的关系，对临床指导治疗、判断预后提供理论依据。

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4ShimizuS,NaritaM,TsujimotoY.Bcl-2familyproteinsregulatethereleaseofapoptogeniccytochromecbythemitochondrialchannelVDAC.Nature,1999,399:483-487.

5Foyouzi-YoussefiR,ArnaudeauS,BornerC,etal.Bcl-2decreasesthefreeCa2+concentrationwithintheendoplasmmicreticulum.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:5723-5728.

6 王养民,王荣霞,哈英娣,等.Bcl-2在膀胱肿瘤中的表达及临床意义.西北国防医学杂志,2000，21：107-108.

7ShiinaH,TgawM,UrakmiS,etal.TmmunohistochemicalanalysisofBcl-2expressionintransitionalcellcarcinomaofbladder.JClinPathol,1996,49:395-399.

8 康元上，石永福，徐鸿毅,等.膀胱癌及癌旁组织p53,Bcl-2的初步研究.肿瘤研究与临床,2002，14：313-315.

9 罗旭，李春鸣.Bcl-2在膀胱癌中的表达及意义.贵州医药,2001，25：582-583.

10 习小庆,葛根,彭瑞元,等.膀胱癌组织中Bcl-2癌蛋白分布及意义.中华泌尿外科杂志,1997,18:304-305.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.10.012

050051 河北省石家庄市第一医院泌尿外科(杨立军、苏晓哲、吴亚东、李珅)；河北省石家庄市第二医院中西医结合科(郑文武)；河北省辛集市中西院中西医结合外科(周安传)

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1002-7386(2017)10-1486-04

2016-11-15)