乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白与临床特征的关系

丁明剑 杨文华 白杨 崔国忠 戴殿禄

·论著·

乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白与临床特征的关系

丁明剑 杨文华 白杨 崔国忠 戴殿禄

目的 研究乳腺癌患者在治疗前后外周血中转化生长因子β1(TGF-β1)与P53蛋白含量变化，初步探讨二者与乳腺癌患者各项临床特征之间的关系。方法 选取乳腺癌患者80例作为乳腺癌组，30例乳腺增生女性作为乳腺增生组。通过酶联免疫吸附试验分别测定乳腺癌患者于治疗前后外周血中TGF-β1与P53蛋白含量变化，与乳腺增生组对照，说明其治疗前后的浓度变化及与乳腺癌各项临床特征之间的关系。结果 乳腺癌患者中外周血中TGF-β1及P53蛋白的含量显著高于乳腺增生组(P<0.05)，且经过有效的治疗后，二者的含量显著下降(P<0.05)。TGF-β1与P53蛋白的含量在肿瘤的组织学分级及腋下淋巴结转移与否有显著的关联(P<0.05)，与乳腺癌组织中的雌激素受体表达无显著相关(P>0.05)。乳腺癌患者的周血中TGF-β1与P53蛋白含量呈正相关(r=0.348,P<0.01)。结论 乳腺癌患者外周血中TGF-β1与P53蛋白的含量显著增高，且与肿瘤组织学分级及腋下淋巴结是否转移显著相关，能够为乳腺癌的临床治疗工作提供新的靶点及思路。

TGF-β1；P53；乳腺肿瘤；酶联免疫吸附

转化生长因子β1(transforming growth factor-β,TGF-β1) 是一种具有多种生物活性的多肽类细胞因子，在肿瘤的发展过程中,TGFβ1信号通路失衡或者发生改变，多种癌基因发生突变，肿瘤细胞分泌大量的活性TGF-β1，改变肿瘤细胞外的微环境，从而由抑制肿瘤的生长演变成为促进肿瘤浸润转移[1,2]。而P53基因是迄今了解最多的抑癌基因之一，野生型的P53基因对于细胞的生长、分化及增殖起着重要的调控作用，而突变型的P53基因则与多种恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。研究发现，TGF-β1调节通路中的某些促癌基因的转录激活需要突变型的P53基因[3]，说明二者之间在肿瘤的发生发展过程中有着密不可分的联系。乳腺癌是目前临床工作中较为常见的一种恶性肿瘤，其发病率逐年升高，复发转移风险高，外周血中尚无特别灵敏有效的肿瘤标记物来判断乳腺癌患者的相关临床与病理特征，我们通过酶联免疫吸附法测定乳腺癌患者外周血中的TGF-β1及P53蛋白的含量，初步探讨二者与乳腺癌临床特征之间的关系及二者之间是否存在着某种关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取沧州市中心医院2003年6月至2008年6月经病理证实的乳腺癌患者80例，均为女性，年龄26～72岁，中位年龄46.8岁，所有患者行乳腺癌改良根治术，术后给予蒽环类及紫杉醇药物为主的化疗6～8周期，腋下淋巴结3枚或3枚以上者行局部放射治疗。其中组织学分级Ⅰ～Ⅱ级患者59例，Ⅲ级患者21例，有腋下淋巴结转移者39例，ER表达阳性者21例，有乳腺癌家族史者13例，已绝经者42例。另外随机选取我院体检中心乳腺增生女性患者30名作为乳腺癌组。

1.2 标本收集 3组患者均取晨起空腹静脉血5 ml，其中乳腺癌治疗前组均未进行任何治疗前抽取，乳腺癌治疗组则在患者规范完成所有治疗后抽取，3 000 r/min离心10 min提取血清，-20℃保存，1周内测定。

1.3 酶联免疫吸附法 采用双抗体夹心法进行酶联免疫吸附实验，TGF-β1检测试剂盒购于Genzyme公司，P53蛋白试剂盒购于上海森雄公司，按照实验说明书进行操作，具体的实验步骤为加样、温育、配液、洗涤、加酶、显色、终止反应、测量吸光度，实验重复3次，采用Germany M5000酶联免疫分析仪，检测指标浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TGF-β1及P53蛋白的含量。

2 结果

2.1 乳腺癌组及乳腺增生组外周血中TGF-β1及P53蛋白含量 乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量显著高于乳腺增生组，二者比较差异有统计学意义(t值分别为12.606和24.352，P=0.000)。见表1。

项目乳腺癌治疗前组(n=80)乳腺增生组(n=30)t值P值TGF⁃β1 96．3±16．456．6±8．312．6060．000P53蛋白167．3±20．270．9±5．524．3520．000

2.2 乳腺癌患者治疗前后TGF-β1及P53蛋白含量的变化 经过有效治疗后，乳腺癌患者外周血中的TGF-β1、P53蛋白含量与治疗前比较均有明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别治疗组治疗后t值P值TGF⁃β196．3±16．467．8±9．115．1020．000P53蛋白167．3±20．277．7±7．735．9060．000

2.3 治疗前TGF-β1的含量与乳腺癌临床特征之间的关系 乳腺癌患者外周血中TGF-β1的含量在不同年龄、绝经状态、肿瘤家族史、肿瘤大小等方面差异无统计学意义(P>0.05)，但在肿瘤的组织学分级及腋下淋巴结转移与否有显著的关联(P<0.05)。见表3。

2.4 治疗前P53蛋白的含量与乳腺癌临床特征之间的关系 乳腺癌患者外周血中P53的含量在不同年龄、绝经状态、肿瘤家族史、肿瘤大小等方面差异无统计学意义(P>0.05)，但在肿瘤的组织学分级及腋下淋巴结转移与否有显著的关系(P<0.05)。见表4。

2.5TGF-β1与P53蛋白与乳腺癌组织中ER表达之间的关系TGF-β1与P53蛋白与乳腺癌组织中的雌激素受体表达无明显关联(P<0.05)。见表5。

2.6 乳腺癌患者外周血中TGF-β1与P53蛋白二者之间的关系：以治疗前乳腺癌患者外周血中TGF-β1含量为横轴，P53蛋白的含量为纵轴，绘制散点图，可见二者表达情况呈正相关(r=0.348，P=0.002)。见图1。

临床病理特征数值t(F)值P值年龄(岁) >50(n=43)98．2±18．0 <50(n=37)94．0±14．31．1680．248绝经状态 未(n=38)98．1±17．6 已(n=42)94．6±15．30．9480．346家族史 有(n=13)88．8±17．4 无(n=67)97．5±16．01．7760．08肿瘤大小(cm) <2(n=34)100．0±15．4 2～5(n=38)93．2±13．2 >5(n=8)94．1±18．71．5870．211淋巴结状态 阳性(n=39)104．4±14．2 阴性(n=41)88．5±14．74．9270．000组织学分级 Ⅰ～Ⅱ级(n=59)90．2±16．0 Ⅲ级(n=21)105．8±12．24．6530．000

临床病理特征数值t(F)值P值年龄(岁) >50(n=43)121．3±44．8 <50(n=37)113．8±31．10．8810．381绝经状态 未(n=38)121．0±41．9 已(n=42)103．8±13．91．610．109家族史 有(n=13)130．1±44．9 无(n=67)115．8±37．51．1110．270肿瘤大小(cm) <2(n=34)167．4±19．0 2～5(n=38)169．2±20．7 >5(n=8)157．3±33．71．1460．323淋巴结状态 阳性(n=39)130．84±40．3 阴性(n=41)104．9±31．93．270．002组织学分级 Ⅰ～Ⅱ级(n=59)161．8±17．6 Ⅲ级(n=21)175．1±21．43．0640．003

3 讨论

TGF-β1在恶性肿瘤的发展过程中起着双重作用。在癌变的早期，TGF-β1诱导上皮细胞凋亡而产生抑制癌变的作用。随着肿瘤的发展，肿瘤细胞逃逸了TGFβ1的抑制作用，同时分泌大量的活性TGF-β1，改变了肿瘤细胞外的微环境，促进肿瘤细胞的血管生成，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移，目前TGF-β1这种从抑制癌变到促进癌变的转换机制并不十分明确[1-4]。人P53基因定位于17号染色体，其野生型编码产物为一大小为53kD的磷酸化蛋白，参与细胞周期调控、细胞分化、细胞程序化死亡等多种病理生理过程，易分解，不宜检测。而研究证实，突变型的P53基因编码产物稳定性强，不易水解，于组织细胞中堆积，可以被免疫组化方法检测[5,6]，且其在人类大多数肿瘤中均有突变，如在肺癌患者中其突变率高达80%以上[7]。LEE等[8]证实在哺乳类细胞动物中，P53基因发生突变，均可以使TGF-β1的生长抑制作用转换成为生长促进作用，且在结肠癌患者中，TGF-β1和P53与其病理分期程相关，且P53的表达强度与TGF-β1及其下游信号通路的Smad蛋白相关，二者表达程协同增强[9]。因此，我们可以得出结论，突变型的P53基因与TGF-β1的密切相关，二者的协同表达很可能在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用，而且，突变型的P53基因极有可能在TGF-β1对于肿瘤细胞的双重作用的转换中扮演着重要的角色。

项目ER阳性ER阴性t值P值TGF⁃β193．9±15．598．1±17．31．1330．261P53蛋白170．4±20．2166．2±20．00．6960．491

图1 乳腺癌患者外周血中TGF-β1与P53蛋白二者之间的关系

乳腺癌的发生发展，涉及到多个癌基因与抑癌基因、多个信号同路的转变，目前研究发现在恶性肿瘤的进展过程中，TGF-β1能够促进恶性肿瘤的侵袭、转移，与胃癌[10]、肺癌[11]、结肠癌[12]、乳腺癌[13,14]等多种恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系，但是TGF-β1由抑制肿瘤细胞的生长转化成促进肿瘤细胞的生长机制并不明确。同时P53基因的突变与多种恶性肿瘤的关系已经得到证实[5-7]，那么TGF-β1与P53蛋白在乳腺癌的发生发展过程中扮演者什么样的角色，以及二者之间的关系目前并不明确。在本研究中，我们通过检测乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白含量并与健康人群对比，发现其含量均显著高于健康人群，且二者呈显著正相关。据此，我们可以推测TGF-β1和P53蛋白在乳腺癌发生发展过程中，起着重要的促进作用，很有可能的机制是，在TGF-β1对于癌细胞的双重作用转换中，P53基因的突变是其重要的“分子开关”之一。同时，在规范的治疗周期结束之后，乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量显著下降，证实治疗有效，也更加印证外周血中TGF-β1和P53蛋白与乳腺癌的发生发展成正相关，同时也能够说明联合检测乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量有可能能够成为筛查乳腺癌患者的指标之一，对于肿瘤的治疗应答也具有一定的检测价值。

同时在本研究中，我们也对乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量与其各项临床特征进行了研究。目前已经证实乳腺癌患者的组织学分级及腋下淋巴结转移状态与其预后呈显著相关[15]，Bao等[16]研究发现乳腺癌组织中TGF-β1的表达含量愈高，其腋下淋巴结转移的数目愈多，其无瘤生存时间愈短，而本研究中证实乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量愈高，其组织学分级愈差，腋下淋巴结转移愈多，与Bao等[16]研究结果是一致的，也就是说明乳腺癌患者外周血中TGF-β1和P53蛋白的含量愈高，患者的预后越差。因此，TGF-β1和P53蛋白也有望成为判断乳腺癌患者预后的指标之一，而对于雌激素受体的表达，我们并没有发现乳腺癌患者外周血中的TGF-β1和P53蛋白含量与之有关。

TGF-β1的含量增高，如何参与肿瘤的浸润转移过程，P53蛋白是否参与其中，目前并不十分明确。大多数研究者认为[17]，正常组织细胞中依赖于Smad的TGF-β1信号传导通路与Smad非依赖性的TGF-β1信号传导通路处于平衡状态，两者可以相互调节，而肿瘤细胞中这种平衡被破坏。Lang等[18]发现TGF-β1能够促进uPA/PAI-1等细胞因子的活化，从而参与乳腺癌的复发与转移，也有研究证实TGF-β1介导SMAD3/SMAD4信号传导通路参与了肿瘤的复发转移，而P53蛋白的表达升高是否参与TGF-β1的促癌作用[19]，目前尚未见国内外相关报道，因此，TGF-β1含量上调在乳乳腺癌发生发展过程中其具体的分子机制则有待于进一步研究。

综上所述，通过联合检测乳腺癌患者外周血中的TGF-β1和P53蛋白含量，可对于判断乳腺癌的发展转归具有一定的意义，同时针对TGF-β1和P53蛋白的靶向治疗也有望能够为乳腺癌的临床治疗提供新的思路。

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Correlation between the changes of TGF-β1,P53 protein levels in peripheral blood and clinical characteristics in patients with breast cancer

DINGMingjian,YANGWenhua,BAIYang,etal.
DepartmentofOncology,CentralHospitalofCangzhouCity,Hebei,Cangzhou061000,China

Objective To observe the changes of TGF-β1,P53 protein levels in peripheral blood of patients with breast cancer in order to explore the correlation between the two factors and clinical characteristics of nreast cancer.Methods Eighty patients with breast cancer were enrolled as breast cancer group, and 30 patients with hyperplasia of mammary glands were served as mammary glands hyperplasia group (MGH group). The expression levels of TGF- β 1 and P53 protein in peripheral blood of patients with breast cancer before and after treatment were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), which were compared with those in patients with hyperplasia of mammary glands. Moreover the correlation between the changes of expression levels of TGF-β1,P53 protein before and after treatment and clinical characteristics of breast cancer was analyzed.Results The expression levels of TGF-β1 and P53 protein in breast cancer group were significantly higher than those in MGH group (P<0.05).Aftertreatment,theexpressionlevelsofTGF-β1andP53proteinwereobviouslydecreased(P<0.05).TheexpressionlevelsofTGF-β1andP53proteinwerecloselycorrelatedtohistologicalgradingandaxillarylymphnodemetastasisofbreastcancer(P<0.05),however,whichwerenotrelatedwiththeexpressionlevelsofestrogenreceptorinbreastcancertissues(P>0.05).MoreovertheexpressionofTGF-β1waspositivelycorrelatedtothatofP53protein(r=0.348,P<0.01).Conclusion The expression levels of TGF-β1and P53 protein in peripheral blood of patients with breast cancer are obviously increased, moreover,which are closely correlated to histological grading and axillary lymph node metastasis of breast cancer,therefor,which can provide new targets and ideas for clinical treatment of breast cancer

TGF-β1; P53; breast cancer; enzyme linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.10.003

061000 河北省沧州市中心医院

戴殿禄，061000 河北省沧州市中心医院；

E-mail:czssl@tom.com

R

A

1002-7386(2017)10-1453-04

2016-11-16)