活血降糖饮对长期高脂饲料喂养大鼠胰岛β细胞凋亡的影响❋

楚淑芳,李惠林,刘德亮,赵恒侠

( 广州中医药大学深圳临床医学院，深圳市中医院，广东 深圳 518033)

【实验研究】

活血降糖饮对长期高脂饲料喂养大鼠胰岛β细胞凋亡的影响❋

楚淑芳,李惠林△,刘德亮,赵恒侠

( 广州中医药大学深圳临床医学院，深圳市中医院，广东 深圳 518033)

目的: 研究活血降糖饮对长期高脂饲料喂养大鼠胰岛β细胞凋亡的影响及其分子机制。方法: 采用长期(28周) 高脂喂养建立胰岛素抵抗、高脂血症大鼠模型，按随机数字表法分为模型组、中药组、贝特组，另设正常对照组。药物干预治疗后行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)及胰岛素释放试验(IRT)，并测定各组大鼠生化指标及凋亡相关蛋白表达、胰腺组织病理学及脂肪含量。结果: 与模型组比较，中药组大鼠 OGTT、IRT明显改善，甘油三酯( TG)、血清总胆固醇( TC)、低密度脂蛋白胆固醇( LDL-C)、游离脂肪酸( FFA) 明显降低，而高密度脂蛋白胆固醇( HDL-C)明显升高。与正常组比较，模型组大鼠胰腺TG含量明显升高，胰腺可见明显脂肪沉积，胰岛β细胞凋亡明显增加；与模型组比较，中药组和贝特组胰腺脂肪含量明显减少，胰腺脂肪沉积明显改善，胰岛β细胞凋亡明显减少。相关性分析表明，胰岛β细胞凋亡指数与胰腺TG含量呈正相关。与正常组比较，模型组大鼠胰腺Bcl-2蛋白表达明显下调，Bax蛋白表达明显上调，而中药组和贝特组大鼠胰腺Bcl-2蛋白表达明显上调，Bax蛋白表达明显下调。结论: 活血降糖饮防治脂毒性所致大鼠胰岛细胞凋亡的作用可能与调节胰腺Bcl-2和Bax蛋白表达有关。

活血降糖饮；高脂血症；胰岛素抵抗；β细胞凋亡

临床研究表明，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者常在诊断前数年至数十年就有脂代谢紊乱，进而血液中游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平升高，长期暴露于高浓度FFA下，脂肪异位沉积，致胰岛β细胞功能受损，诱导其凋亡和坏死，进而胰岛素分泌减少、糖异生增加，其中以诱导β细胞凋亡为主[1]。因此，抑制胰腺脂肪沉积，预防β细胞脂毒性凋亡可能成为防治T2DM的新靶点。活血降糖饮具有益气养阴、活血通络的作用，由黄芪、生地、丹参等12味中药组成。前期研究证实，其有良好的调脂降糖作用及可能的作用机制[2]。本研究主要研究其对胰腺脂肪沉积、胰岛β细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及饲养

SPF级健康雄性2月龄SD大鼠40只，体质量150～180 g，购于广东省实验动物中心。动物饲养于SPF级动物实验中心，温度20℃、湿度60%左右，每日光照时间12 h，自由摄食、饮水，饲料由南方医科大学实验动物中心提供。常规饲料成分为碳水化合物64%，蛋白质23%，脂肪13%；高脂饲料热量组成为碳水化合物20%，蛋白质20%，脂肪60%。

活血降糖饮组方：黄芪30 g，生地20 g，太子参30 g，桃仁10 g，红花12 g，丹参30 g，五味子15 g，麦冬15 g，山药12 g，黄精15 g，丹皮12 g，大黄16 g。上药煎煮、过滤并制成浓度为4 g/mL浓缩液。非诺贝特胶囊(法国利博福尼制药公司生产)制成浓度为2 g/L的混悬液，溶剂为双蒸水。

1.3 试剂与仪器

TUNEL试剂盒购于罗氏公司，胰岛素、B淋巴细胞瘤-2(B-cell Lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)、兔抗大鼠抗体购于CST公司，山羊抗兔Dylight-800荧光二抗购自KPL公司。检测仪器有电泳槽(DYCZ-24型)、酶标仪(北京六一仪器厂)、德国蔡司LSM710激光共聚焦显微镜、JEM-1200EX型透射电镜(日本)、Quantity One定量分析软件及HMIAS-2000图像分析系统。

1.4 试验方法

1.4.1 动物模型建立和分组 适应性喂养2周，随机选出8只作为正常组普通饲料喂养。其余给予高脂饲料喂养28周后，根据血清TC、TG、FFA、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)水平筛选出24只成模大鼠，随机分为模型组、中药组、贝特组各8只。

1.4.2 动物处理 中药组以5 g/kg/d的剂量灌服中药煎剂，贝特组以20 mg/kg/d的剂量灌服非诺贝特混悬液，正常组和模型组以等体积双蒸水灌胃，模型组、中药组、贝特组均喂以高脂饲料。

1.4.3 标本制备 治疗后行OGTT及IRT实验。以10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清用于检测生化指标等。取胰腺组织，以4%多聚甲醛固定，剩余胰腺组织储存于液氮中。

周末，许元生照例沉浸在他的代码世界里，如芸也如法炮制，要逼他学做饭。他在厨房里叮叮当当了半天，才端出一碗黑乎乎的面条，还没等她批评他，他却红了眼圈，“我只想安安静静地码个代码，不行吗？”

1.4.4 指标测量 血清学指标按照试剂盒说明书检测。 胰腺组织脂肪含量的测定： 100 mg胰腺加100 μL组织脂质匀浆缓冲液在4℃冰水浴匀浆后，取10 μL加入TritonX-100、三甲基甲醇10 μL和甲醇混合液(v/v=1/1)5 μL混匀，离心取上清，用酶法测定TG含量，并计算胰腺组织TG含量。Western blot测定胰腺组织Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达，提取总蛋白并测定蛋白浓度；取50 μg蛋白，采用10% SDS-PAGE 凝胶，转膜、封闭2 h再用抗体稀释液稀释一抗，4℃过夜。第2天洗膜后用1∶5000的山羊抗大鼠二抗摇床孵育2 h，进行杂交ECL化学发光。用凝胶成像系统分析条带的吸光度，用蛋白/内参表示蛋白的表达量。

1.4.5 病理学检测 观察胰腺的形态大小、颜色、质地，并取胰尾部固定、石蜡包块、HE染色，在光镜下观察胰岛及其细胞情况。

1.4．6 电子显微镜检测胰岛细胞凋亡情况 取新鲜胰腺组织1 mm3，经修块清洗后放入2.5%戊二醛中前固定4 h，PBS清洗，放入1%锇酸中后固定2 h，脱水、包埋放入烤箱中聚合72 h，超薄切片机上切片，经硝酸铅和醋酸铀双重染色后，在JEM-1200EX型透射电镜中观察。

1.4.7 原位末端核苷酸标记法(TUNEL)检测胰岛β细胞凋亡 按TUNEL试剂盒说明书操作，并在激光共聚焦显微镜下观察。从每个胰腺中取6张双染切片，每张切片中取10个视野计算凋亡指数。

2 结果

2.1 各组大鼠 OGTT水平比较

表1图1显示，模型组大鼠血清OGTT各点血糖水平较正常组均升高(P<0.01)；2治疗组大鼠OGTT结果比模型组各个时间点的血糖水平均有明显下降 (P<0.01)。

组 别鼠数血糖(mmol/L)0h0 5h1h2h3h正常组85 70±0 687 03±0 797 56±0 857 23±0 747 35±0 48模型组86 91±0 62∗∗10 46±1 73∗∗10 95±1 57∗∗10 18±1 39∗∗10 26±1 06∗∗中药组85 69±0 81▲▲7 53±1 60▲▲7 64±1 25▲▲7 90±0 77▲▲8 11±0 75▲▲贝特组85 67±0 50▲▲8 23±0 81▲8 68±0 76▲▲8 31±1 07▲▲9 00±1 21

注：与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:▲P<0.05,▲▲P<0.01

图1 OGTT结果

图2 IRT结果

2.2 各组大鼠IRT水平比较

表2图2显示，模型组大鼠血清IRT各点胰岛素水平较正常组均升高(P<0．01)，2治疗组比较模型组各点胰岛素水平均有不同程度降低 (P<0.01)。

组 别鼠数0h0 5h1h2h3h正常组860 64±22 17147 79±24 44109 05±28 7384 09±14 5987 89±22 96模型组8119 97±34 87∗∗161 47±29 92172 61±35 54∗∗153 24±42 93∗∗120 12±11 53∗∗中药组870 40±17 49▲▲106 10±20 20▲▲149 49±29 5391 05±22 24▲▲86 58±13 21▲▲贝特组872 80±20 63▲▲113 30±24 22▲▲136 06±29 84124 71±42 73▲▲79 07±13 97▲▲

注：与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.3 各组大鼠HOMA-IR、ISI水平及胰腺TG含量比较

表3显示，模型组大鼠HOMA-IR、胰腺TG含量较正常组明显升高(P<0.01)，而ISI水平明显降低(P<0.01)；2治疗组HOMA-IR、胰腺TG含量与模型组比较均明显降低(P<0.01)，ISI水平明显升高(P<0.05)。

2.4 各组大鼠血脂水平比较

表4显示，模型组较正常组血HDL-C 降低(P<0.01)，TC、TG、LDL-C、FFA 均升高(P<0.01)；中药组、贝特组血HDL-C 升高(P<0.01)，TC、TG、LDL-C、FFA均降低(P<0.01)。

组 别鼠数HOMA-IRISI胰腺TG含量(μmol/g)正常组814．82±4．05 -5．77±0．314．59±1．17模型组836．20±8．08∗∗-6．68±0．22∗∗7．21±0．78∗∗中药组818．02±5．29▲▲-5．95±0．39▲▲5．39±1．37▲▲贝特组818．62±5．86▲▲-5．98±0．41▲▲5．54±0．92▲▲

注：与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:▲▲P<0.01

组 别鼠数TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)FFA(mmol/L)正常组83．16±0．731．54±0．141．62±0．360．50±0．110．68±0．12模型组84．61±0．94∗∗2．49±0．26∗∗3．02±0．61∗∗0．30±0．072∗∗1．62±0．37∗∗中药组83．42±0．67▲2．04±0．22▲▲2．08±0．57▲▲0．33±0．051．09±0．19▲▲贝特组83．49±0．62▲1．98±0．18▲▲2．03±0．39▲▲0．35±0．081．00±0．25▲▲

注：与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:▲P<0.05,▲▲P<0.01

图3 各组大鼠胰腺组织病理学结果比较(HE染色×400)注：A.正常组；B.模型组；C.中药组；D.贝特组

2．5 胰腺组织电镜结果

正常组大鼠胰岛β细胞核(图4A)呈规则卵圆形，胞浆内散在分布线粒体、内质网结构清晰，大量分泌颗粒散布于胞浆内，分泌颗粒呈圆形且密集，外有界膜包绕，内有清晰、明亮的晕。模型组胰岛β细胞核(图4B)缩小、不规则，染色质边集，有大量类圆形电子密度较小的脂滴堆积，胞浆内分泌颗粒显著减少。中药组胰岛β细胞核(图4C)形态尚规则，核仁清晰，胞浆内脂滴沉积较模型组少，分泌颗粒数量比模型组多。贝特组胰岛β细胞核(图4D)形态尚规则，少量染色质边集，有少量脂滴沉积，分泌颗粒数量较模型组多。

图4 胰腺组织电子显微镜观察(电子显微镜×5000)注：A.正常组；B.模型组；C.中药组；D.贝特组

2.6 各组大鼠胰岛β细胞凋亡指数比较

图5、6显示，细胞凋亡指数在模型组升高，明显高于正常组(P<0.01)，而与模型组比较，各治疗组的细胞凋亡指数均下降(P<0.05)。通过均数分析胰腺脂肪含量和胰岛β细胞凋亡指数的相关性，发现二者呈正相关(r=0.993，P=0.004)。

图5 各组大鼠胰岛β细胞凋亡指数

图6 胰腺脂肪含量和胰岛β细胞凋亡指数的相关性

2.8 胰腺Bcl-2、Bax蛋白表达

图7、8显示，Western blot检测发现，模型组胰腺Bcl-2蛋白表达较正常组明显下调，Bax蛋白表达明显上调(P<0.01)，而各治疗组胰腺Bcl-2蛋白表达明显上调，Bax蛋白表达明显下调(P<0.01)。

3 讨论

非脂肪组织过多的脂肪沉积和高FFA与T2DM的发生密切相关。一方面FFA在外周的胰岛素敏感组织如骨骼肌、脂肪中，使胰岛素信号传导发生障碍，另一方面可使分泌的胰岛素增多，并代偿性导致胰岛细胞增生。随着疾病的发展，胰腺中沉积的脂肪越来越多，β细胞的功能因此发生障碍甚至可引起细胞凋亡，2型糖尿病的发生即基于此。有学者研究，胰腺TG含量在正常血糖肥胖、糖耐量受损和T2DM患者中逐渐升高，且与β细胞功能呈负相关[3]。同时离体实验表明，长期暴露于高浓度FFA中，β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少，细胞内TG含量增加[4]。动物实验则发现，Zucker肥胖大鼠整个胰腺内均出现脂肪沉积，且发生在血糖升高之前[5]。

中医理论认为，长期高脂饮食导致内消中满，中满生内热，内热伤阴耗气导致气阴两虚，引起细胞死亡，导致糖尿病的发生。因此，糖尿病以阴虚或气阴两虚为根本。国内大量研究认为，益气养阴中药或复方具有治疗糖尿病、抑制胰岛细胞凋亡的作用。如郑燕芳等研究表明，具有益气养阴的中药石斛合剂、生脉饮、玉液汤等均具有抑制离体培养的胰岛细胞凋亡的作用[6]。赵静等学者则认为，生地、黄连单药及配伍均能够抑制T2DM模型大鼠胰岛细胞凋亡[7]。

本研究中，高脂血症和胰岛素抵抗大鼠模型是通过长期高脂饮食喂养而成功诱导，表现为糖耐量异常、高胰岛素血症、胰岛素抵抗指数升高和敏感指数降低、血清FFA升高。胰腺组织HE染色观察发现，胰岛细胞的变化主要表现在数量的减少，形态由类圆形变为不规则，细胞出现空泡样改变，脂肪浸润较重， TG含量也随之升高。电子显微镜观察虽现典型的凋亡小体，但发现模型组大鼠胰岛β细胞出现染色质边集，有大量类圆形电子密度较小的脂滴堆积，胞浆内分泌颗粒减少等凋亡早期表现。且通过TUNEL荧光双染色发现，模型组β细胞凋亡指数明显增加，而经活血降糖饮治疗后，β细胞凋亡明显改善。在本研究中，我们首次证实活血降糖饮治疗T2DM的机制之一可能是减轻β细胞凋亡，这可能与减少胰腺脂肪含量和脂毒性相关。

Bcl-2家族蛋白位于线粒体的外膜，对于调节细胞凋亡具有重要作用。当各种致凋亡因子作用于细胞，导致线粒体抗凋亡和促凋亡基因表达失衡，可能影响线粒体的稳态，引起线粒体释放细胞色素C(Cytochrome C, Cyt C)，胞浆中的Cyt C在ATP/dATP存在的情况下，可以与凋亡蛋白酶活化因子1(Apoptotic Protease Activating Factor-1, Apaf-1)结

图7 各组大鼠胰腺组织中Bcl-2蛋白的表达注：与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:▲▲P<0.01

图8 各组大鼠胰腺组织中Bax蛋白的表达注：与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:▲▲P<0.01

合，形成Cyt C/Apaf-1复合体，募集胞浆中的Caspase 9前体，启动Caspase级联反应，引起细胞凋亡[8]。国外有学者报道，离体人胰岛细胞在1.0-2.0mmol/L的FFA环境中培养48 h，细胞凋亡比例随FFA浓度增加而提高[9]。胞内Bcl-2表达下调，但Bax无变化，如果阻断Caspase级联反应则能阻止FFA诱导的细胞凋亡，说明高浓度FFA诱导的细胞凋亡主要由线粒体凋亡途径调控[10]。Shimabukuro M等学者研究也认为，高FFA暴露会下调Bcl-2表达[11]。本研究结果表明，长期高脂饲料喂养会导致胰岛β细胞凋亡，胰腺Bcl-2蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调，而经活血降糖饮治疗后β细胞凋亡明显改善， Bcl-2/Bax的失衡得到回调，说明活血降糖饮抗凋亡的作用可能是通过调节线粒体途径发挥作用。

综上所述，活血降糖饮能够抑制高脂饮食诱导的大鼠胰腺脂肪沉积和胰岛细胞凋亡，其可能的作用机制是与调节细胞凋亡线粒体途径中的Bcl-2和Bax蛋白表达有关。

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Effects of Huoxue Jiangtang Decoction on Apoptosis of Islet β Cells in Rats Fed with High Fat Diet

CHU Shu-fang, LI Hui-lin△，LIU De-liang，ZHAO Heng-xia
(GuangzhouUniversityofChineseMedicineClinicalMedicalCollegeofShenzhen，ShenzhenTraditionalChineseMedicineHospital)，GuangdongShenzhen518033，China)

Objective: To study the molecular mechanism and effect of Huoxue-Jiangtang prescription on inhibiting pancreatic β cell apoptosis in hyperlipidemia and insulin resistance rats．Methods: High fat diet for 28 weeks, in order to establish the rat model of hyperlipidemia and insulin resistance.The model rats were randomly assigned to model group，the traditional Chinese medicine group (Huoxue-Jiangtang prescription) and fenofibrate group．Corresponding therapy were given through gastric tube for rats in different treatment groups. Meanwhile a control group was set up in normal animals. Oral glucose tolerance test (OGTT),insulin releasing test (IRT)，serum lipid level, and apoptosis related proteins were detected. Histology and fat content of pancreas were examined，TUNEL and electron microscope were used to evaluate pancreatic β cell apoptosis．Results: In contrast to the control group, the TG content and protein expression of Bax in pancreas tissue were increased, and pancreas fat deposition and early β cell apoptosis were found in model group, Meanwhile, β cell apoptosis index was increased while protein expression of Bcl-2 was reduced in model group. In comparison with model group, the TG content and protein expression of Bax were decreased in pancreas, pancreas fat deposition and cell apoptosis index was decreased in Huoxue-Jiangtang decoction treated group. Besides, the protein expression of Bcl-2 was increased in Huoxue-Jiangtang decoction treated group. Correlation analysis revealed that β cell apoptosis index was positively correlated with pancreas TG content. Conclusion: It suggested that Huoxue-Jiangtang prescription is effective on treating hyperlipidemia and insulin resistance in rats．The mechanism of preventing β cell apoptosis may be related to the regulation of protein expression of Bcl-2 and Bax in pancreas.

Huoxue-Jiangtang Prescription; Hyperlipidemia; insulin resistance; pancreatic β cell apoptosis

国家自然科学基金资助项目(81173253)-益气养阴活血中药对胰岛-β细胞脂凋亡的影响

楚淑芳(1984- )，女，在读博士，从事中医药防治内分泌及代谢性疾病的临床与研究。

△通讯作者：李惠林(1963- )，男，主任医师，教授，从事中医药防治内分泌及代谢性疾病的临床与研究，Tel: 13602666389， Email:sztcmlhl@163.com

R285.5

B

1006-3250(2017)04-0496-04

2016-06-11