RSK 4与TRAF4在不同乳腺细胞中的表达及分子作用通路研究

杨宁朱佳郇雪洁伍越杨华伟

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院乳腺一区；2广西医科大学研究生院

林欢1，2朱小东1，3，4陈泽昙1，2李龄1，3，4曲颂1，3，4赵伟1，3苏芳1，3韦静妮1，3梁忠国1，3莫柒艳1，2武江波1，2蒙慧玲1，2

基础研究

RSK 4与TRAF4在不同乳腺细胞中的表达及分子作用通路研究

杨宁1，2朱佳1，2郇雪洁1，2伍越1，2杨华伟1

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院乳腺一区；2广西医科大学研究生院

目的 研究抑癌基因p90核糖体S6蛋白激酶4（p90 ribosomal protein S6 kinase 4，RSK4）相互作用蛋白与肿瘤坏死因子受体相关因子4（tumor necrosis factor receptor associated factor 4，TRAF4）在不同乳腺细胞株中的表达，探讨RSK4-TRAF4相互作用蛋白所在分子作用通路对乳腺癌侵袭转移的影响。方法 采用实时荧光定量PCR法检测RSK4和TRAF4在HBL-100正常乳腺细胞株和MCF-7、H er-2阳性型、MDA-MB-231人乳腺癌细胞株中的表达情况。用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测RSK4和TRAF4以及MAPK通路下游蛋白ERK1/2在HBL-100、MCF-7、H er-2阳性型、MDA-MB-231 4种乳腺细胞株中的表达。结果 RSK4mRNA、TRAF4mRNA在4种细胞中均表达，RSK4mRNA在HBL-100表达量最高，在MCF-7、H er-2阳性型、MDA-MB-231细胞中含量依次降低；TRAF4mRNA在4种细胞中的表达量由低到高依次为HBL-100、MCF-7、H er-2阳性型、MDA-MB-231细胞，RSK4mRNA、TRAF4mRNA在4种细胞中两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。RSK4与TRAF4在4种细胞中蛋白表达水平与mRNA表达水平相一致，具有高度相关性（rRSK4＝0.92，P＜0.01；rTRAF4＝0.82，P＜0.01）；ERK1/2蛋白表达量由高到低依次为MDA-MB-231、H er-2阳性型、MCF-7、HBL-100。在mRNA转录水平，RSK4和TRAF4表现出负相关（r1＝－0.81，P＜0.01）；在蛋白翻译水平，RSK4和TRAF4同样呈现出高度负相关（r2＝－0.84，P＜0.01）。结论 RSK4和TRAF4具有较高的负相关性，RSK4与TRAF4相互作用后可能通过MAPKs下游信号通路ERK起分子调控作用。

乳腺肿瘤；人乳腺癌细胞株；p90核糖体S6蛋白激酶4；肿瘤坏死因子受体相关因子4；ERK信号通路

近年来，我国乳腺癌发病率明显上升，每年新增达3%～4%，超过世界水平（1%～2%）。在北京、上海、广州等经济发地区，乳腺癌的发病率居首位［1］。乳腺癌是多基因共同作用的异质性较强的全身性疾病。抑癌基因p90核糖体S6蛋白激酶4（p90 ribosomal protein S6 kinase 4，RSK4）作为丝裂酶原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）信号通路下游重要的调控因子在癌症中的作用越来越受重视。研究表明，RSK4可能是乳腺癌抑癌基因，具有负性调控细胞的功能，干扰表达后可加速乳腺癌细胞转移和侵袭能力［2］。本课题组前期研究结果显示，RSK4与肿瘤坏死因子受体相关因子4（tumornecrosis factor receptorassociated factor 4，TRAF4）存在蛋白质相互作用［3］，因此，我们设想RSK4-TRAF4蛋白质复合物可能通过MAPKs通路下游细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）起分子调控作用。本研究拟初步确定RSK4、TRAF4和ERK1/2在4种乳腺细胞株中的表达水平及两者的相关性，探讨RSK4-TRAF4相互作用蛋白所在分子通路对乳腺癌侵袭、转移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7、H er-2阳性型和正常乳腺细胞株HBL-100均购自上海中科院研究所。

1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM高糖培养液、RPMI1640培养液、PBS购自Gibico公司，胎牛血清购自BI公司，Trizol购自美国 Invitrogen公司；实时荧光定量PCR试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自日本Takara公司；RSK4引物、TRAF4引物和GAPDH引物由Takara南宁代理科迪公司合成；RIPA蛋白裂解液、蛋白上样缓冲液和二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、ECL荧光化学发光试剂盒购自上海碧云天公司；抗RSK4、GAPDH单克隆抗体购自Abcam公司；TRAF4抗体购自Santa cruz公司；HRP标记抗小鼠二抗、兔二抗购自上海康臣生物公司；荧光倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；大型多功能分光光度计购自美国法马西亚公司；实时荧光定量PCR仪和高速多功能冷冻离心机购自美国Thermo公司；凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司；水平电泳仪槽、垂直电泳仪和转膜设备购自北京六一厂；显影设备购自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基在37℃、5%C O2培养箱中培养MDA-MB-231、MCF-7细胞。将H er-2阳性型和HBL-100细胞株培养于含有15%胎牛血清和1%青链霉素混合液的1640培养基中，置于37℃、5%C O2培养箱中培养。待细胞密度达到80%左右时，进行细胞传代。1.2.2 实时荧光定量PCR检测4种细胞中RSK4和TRAF4mRNA的表达 取对数生长期的细胞，按Trizol法提取细胞总RNA，依照实时荧光定量PCR逆转录试剂盒说明书进行逆转录，得到cDNA。根据Genebank数据库结合Primer 6.0软件设计引物（由Takara南宁代理科迪公司合成），引物序列及长度见表1。

表1 相关引物序列

根据SYBR Premix Ex Taq（TliRNaseH Plus）试剂盒操作说明书，反应体系为25μL，SYBR 12.5μL，上下游引物各1μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，cDNA 2μL，双蒸水8μL。反应条件为预变性95℃30 s，变性95℃5 s，退火62℃30 s，共40个循环，每孔设计3个重复孔。Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环，按公式分别计算每组ΔCt，以MDA-MB-231细胞 mRNAΔCt作为参照，RSK4 mRNA的相对表达量为2-ΔΔCt。ΔCt＝Ct平均值（RSK4）-Ct平均值（GAPDH），ΔΔCt＝ΔCt（MCF-7/H er-2阳性型/HBL-100组）-ΔCt（MDA-MB-231组）。

1.2.3 蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测RSK4、TRAF4、ERK1/2蛋白的表达 待细胞长至90%时，用PBS冲洗3次，加入以1（蛋白酶抑制剂）∶50（蛋白裂解液）比例配好的溶液，提取细胞总蛋白，用BCA法测定每组的蛋白浓度。以10%SDS-PAGE进行电泳，用0.22μm孔径硝酸纤维素膜进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，孵RSK4一抗（1∶10 000）、TRAF4抗体（1∶1 000）、ERK1/2抗体（1∶1 000）、GAPDH抗体（1∶10 000）于4℃摇床过夜。TBST洗涤30min，二抗室温孵育1 h。洗膜后ECL试剂发光，用凝胶图像分析系统对电泳条带进行密度扫描后进行灰度分析，以RSK4蛋白与GAPDH蛋白条带的灰度比值反应RSK4蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（）表示，计量资料用t检验，两两比较用LSD检验，相关分析采用Pearson检验。检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4种细胞RSK4 mRNA、TRAF4mRNA的表达

实时荧光定量PCR检测结果如表2所示。

HBL-100、MCF-7、H er-2阳性型细胞分别与MDA-MB-231细胞比较，*P＜0.01

图1 RSK 4 mRNA在4种细胞中的表达

图2 TRAF4 mRNA在4种细胞中的表达

2.2 Western blot检测4种细胞中RSK4、TRAF4和ERK1/2蛋白的表达

4种细胞中TRAF4和ERK1/2蛋白的表达结果如图3，RSK4蛋白的灰度值依次为0.789±0.010、0.683± 0.013、0.602±0.015和0.526±0.006，组间差异有统计学意义（F＝391.8，P＜0.0001）。TRAF4蛋白的灰度值依次为 0.682±0.036、0.744±0.057、0.817±0.059和 0.890± 0.058，组间差异有统计学意义（F＝11.44，P＝0.0008）。RSK4、TRAF4、ERK1/2 3种蛋白在4种细胞中的表达分别两两比较，各组差异均有统计学意义（P＜0.05）。RSK4蛋白表达含量由高到低依次为HBL-100、MCF-7、H er-2阳性型、MDA-MB-231细胞；TRAF4蛋白表达含量由高到低依次为MDA-MB-231、H er-2阳性型、MCF-7、HBL-100；ERK1/2蛋白表达量由高到低依次为MDAMB-231、H er-2阳性型、MCF-7、HBL-100。

图3 4种细胞目的蛋白条带图

2.3 RSK4、TRAF4mRNA与其蛋白表达的相关性

在4种乳腺细胞中，RSK4 mRNA含量与RSK4蛋白表达量一致，前者表达越高，后者表达亦高，两者呈正相关（rRSK4＝0.92，P＜0.01）。TRAF4mRNA与TRAF4蛋白表达也成正相关（rTRAF4＝0.82，P＜0.01）。见图4、图5。

图4 RSK 4 mRNA与其蛋白表达的相关性

图5 TRAF4m RNA与其蛋白表达的相关性

2.4 RSK4和TRAF4表达的相关性

RSK4 mRNA和TRAF4 mRNA两者成负相关（r1＝－0.81，P＜0.01）。在蛋白翻译水平，两者也表现出高度负相关（r2＝－0.84，P＜0.01）。见图6、图7。

图6 RSK 4 mRNA和TRAF4 mRNA表达的相关性

图7 RSK 4蛋白和TRAF4蛋白表达的相关性

3 讨论

目前研究表明RSK4可以抑制肿瘤侵袭及转移，而RSK4是RAS-MAPKs中重要的信号分子，能调控下游ERK信号通路转导，RSK4酶活性主要来自Ser389和Ser232的磷酸化，是MAPKs ERK途径中主要的下游底物［4］，可以被MAPKs磷酸化激活，通过底物磷酸化抑制FGFR2-RAS-ERK信号转导及对特异靶点的转录激活，从而抑制细胞分裂生长和分化［5］，但是其具体调控机制尚未阐明。本课题组前期研究显示RSK4与PRMT5为相互作用的蛋白，而PRMT5和TRAF4是分子伴侣，通过锌指样结构相连接［6］。蛋白质作为生命活动的基本物质，其功能的实现离不开与其他蛋白质相互作用。TRAF4最初在乳腺癌淋巴结组织中提取的mRNA所构建的cDNA文库中经过差异筛选得到，是一种含有环指结构的E3泛素连接酶，在人类多种癌症中过表达［7］，能调控TGF-β诱导的依赖型SMAD和非依赖型SMAD信号通路。上皮间质性转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是乳腺癌发生发展中重要的改变。研究表明，TGF-β可通过诱导EMT这一进程而促进肿瘤细胞运动和转移侵袭能力［8］。目前研究初步证实细胞中TRAF4高表达可促进TGF-β信号通路上游R-Smad活化水平而伴随乳腺癌患者的不良预后［9］。ERK是细胞内多条信号通路的枢纽，其活化与肿瘤细胞的增殖密切相关。多肽转化生长因子TGF-β可以通过各种方式激活RASMAPK-ERK通路，能抑制早期肿瘤的生长，一定程度上阻滞细胞周期和诱导细胞死亡，晚期则促进癌细胞的侵袭和转移［10］。在多种癌症中，RAS-MAPKs与TGF-β信号通路存在相互作用，共同影响肿瘤的发展［11-12］。TGF-β与RAS-MAPKs两条信号通路的相互影响作用较庞大复杂，在乳腺癌中的具体机制尚不明确。本课题组前期通过质谱分析-标签纯化实验，明确了RSK4与TRAF4为相互作用蛋白，我们设想RSK4-TRAF4蛋白质复合物可能是联系TGF-β与RAS-MAPKs信号通路的关键蛋白。本研究初步确定了RSK4、TRAF4和ERK1/2在不同乳腺细胞株中的表达水平及相关性。

实验结果显示，在乳腺癌MDA-MB-231细胞中，ERK1/2表达量增加，RSK4呈低表达，提示乳腺癌的发生发展可能与ERK信号水平升高和RSK4含量降低有关。此外，TGF-β信号能激活RAS通路使ERK信号活性增高，促使肿瘤细胞表型从高分化向低分化过度［13］。由此我们猜测，在乳腺癌中RSK4和TRAF4具有负相关性，但通路机制有待研究。由于目前未有关于RSK4与TRAF4在乳腺癌方面的相关性研究，本实验研究采用体外细胞培养、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法等方法，从转录和翻译水平对人乳腺细胞株HBL-100、MCF-7、H er-2阳性型、MDA-MB-231进行检测，探讨其对乳腺癌的共同影响机制。结果显示4株细胞均表达RSK4和TRAF4，且两者成负相关性，在低侵袭性乳腺癌细胞中，RSK4表达量高，而TRAF4表达量低；在高侵袭性乳腺癌MDA-MB-231细胞中，则反之。本研究利用Weston b lot方法检测了ERK1/2通路蛋白，结果显示细胞表达量由高到低依次为MDA-MB-231、H er-2阳性型、MCF-7、HBL-100。在雌激素受体阴性的高侵袭性细胞系MDA-MB-231中，ERK含量最高，进一步证实了RSK4是R AS-ERK通路中一个重要的抑制因子，能抑制ERK通路的活化和对特异靶点的转录激活。阻断ERK通路可以抑制TGF-β介导的R-Smad丝氨酸位点的磷酸化，并影响ERK-Smad 4异源多聚体复合物的形成，抑制细胞分裂生长和分化［14］。同时，TRAF4在低侵袭性MCF-7细胞中表达量较低，低表达量的TRAF4减弱了TGF-β/Smad对上皮间质性转化的诱导调控能力，减低了乳腺癌细胞的侵袭迁移能力。Zhang等［9］研究发现TRAF4扩增与ERBB2基因扩增有明显相关性。在一个含有2 960例乳腺肿瘤患者的大型公共临床基因芯片数据库中［15］，发现高表达TRAF4的患者预后较差，在H er-2阳性患者中TRAF4高表达也预示着更差的预后，与本实验结果一致，TRAF4的表达量在H er-2阳性型细胞较正常乳腺细胞HBL-100高。在一项实验性肿瘤模型中，H er-2和TGF-β受体信号已被证明在促进肿瘤生存和转移方面具有协同作用［16］。

总之，抑癌基因RSK4是ERK信号通路下游的关键作用分子，TRAF4主要调控TGF-β/Smad信号通路，而ERK通路在平衡TGF-β/Smad信号途径中起重要作用且两个信号通路间存在相互影响的现象。因此，我们推测RSK4-TRAF4蛋白质复合物可能是联系TGF-β与RAS-MAPKs信号通路的桥梁，两者共同影响乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，但其机制尚需进一步研究探讨。

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［2016-11-25收稿］［2017-01-13修回］［编辑 江德吉］

Expression of RSK 4 and TRAF4 in different breast cell lines and cross-talk mechanism

Yang Ning1，2，Zhu Jia1，2，Huan Xuejie1，2，Wu Yue1，2，Yang Huawei1（1Department of Breast Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Yang Huawei.E-mail:lordyhw@163.com

Objective To study the expression of tumor suppressor gene p90 ribosomal S6 kinase 4（RSK4）and the interacting protein tumor necrosis factor receptor-associated factor 4（TRAF4）in different human breast cancer cell lines，and to study the potential role of these proteins in breast cancer invasion and metastasis.M ethods Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）was used to detect themRNA expression of TRAF4 and RSK4 in four human breast cancer cell lines（HBL-100，MCF-7，Her-2-positive type，MDA-MB-231）.Western blotting was used to detect the expression of RSK4，TRAF4 and MAPK pathway proteins downstream of ERK1/2 protein in the same four breast cancer lines.Results RSK4 and TRAF4 mRNAswere expressed in all four cell lines；the highest expression was observed for RSK4 mRNA in HBL-100 cells.Expression of RSK4 mRNA was slightly lower in MCF-7，Her-2-positive type and MDA-MB-231 cells.Expression of TRAF4 mRNA followed the trend:HBL-100Her-2-positive type>MCF-7>HBL-100.RSK4 mRNA levels correlated negativelywith TRAF4mRNA levels（r1=-0.81，P<0.01），and the samewasobserved for protein levels（r2=-0.84，P<0.01）.Conclusions RSK4 and TRAF4 expression negatively correlate with each other，which may be mediated by MAPKs downstream of the ERK pathway.

Breast neoplasms；Human breast cell lines；p90 ribosomal S6 kinase 4；Tumor necrosis factor receptor-associated factor 4；ERK signaling pathway

基础研究

林欢1，2朱小东1，3，4陈泽昙1，2李龄1，3，4曲颂1，3，4赵伟1，3苏芳1，3韦静妮1，3梁忠国1，3莫柒艳1，2武江波1，2蒙慧玲1，2

R737.9

A

1674-5671（2017）01-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.01.08

国家自然科学基金资助项目（81260394）

杨华伟。E-mail：lordyhw＠163.com

【共同第一作者】朱佳