NKD1、β—catenin和Cyclin D1在结直肠癌中的表达及意义

顾磊

[摘要] 目的 觀察裸角质膜同源蛋白（NKD1）、β-连环素（β-catenin）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）在结直肠癌组织中的表达，探讨其在结直肠癌变过程中的意义。 方法 收集2014年1月～2016年1月在鄂东医疗集团黄石市中心医院（我院）行结直肠癌根治术切除的癌症组织96例及27例肠管正常黏膜，并收集同期在我院治疗的38例结直肠腺瘤切除标本，采用SP免疫组化法对所有标本中NKD1、β-catenin和Cyclin D1的表达情况进行检测，分析NKD1阳性率、Cyclin D1阳性率与β-catenin异位表达率三者之间的相关性。 结果 结直肠癌组织中NKD1的阳性率（17.71%）明显低于结直肠正常黏膜（92.59%）及腺瘤组织（78.95%），差异有统计学意义（均P < 0.05）；结直肠癌组织中的β-catenin异位表达率（78.13%）和Cyclin D1阳性率（84.38%）均明显高于结直肠正常黏膜、腺瘤组织中的表达率（42.11%、34.21%），差异有统计学意义（均P < 0.05）；NKD1、β-catenin和Cyclin D1在结直肠腺癌组织中的表达均与癌分化程度、Duke分期、淋巴结转移有关（P < 0.05）。 结论 NKD1、β-catenin和Cyclin D1可能参与了结直肠癌的发生、发展、侵袭和转移，联合检测可判断结直肠癌的生物学行为并作为临床治疗的参考依据。

[关键词] 结直肠癌；裸角质膜同源蛋白；β-连环素；细胞周期蛋白D1

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（b）-0115-04

Expression and significance of NKD1， β-catenin and Cyclin D1 in colorectal cancer

GU Lei

Department of Pathology， Huangshi Central Hospital of Edong Healthcare Group Affiliated Hospital Hubei Polytechnic University， Hubei Province， Huangshi 435000， China

[Abstract] Objective To observe the expression of naked cutin membrane homologous protein （NKD1）， β serial element （β- catenin） and cell cycle protein D1 （Cyclin D1） in colorectal cancer tissues and explore its significance in the process of colorectal cancer. Methods 96 cases of colorectal cancer and intestinal resection of the cancer tissue margin of normal mucosa in 27 cases， 38 cases of colorectal adenoma resection specimens in Huangshi Central Hospital of Edong Healthcare Group from January 2014 to January 2016 were collected. SP immunohistochemical method was used to detect the expression of NKD1， beta -catenin and Cyclin D1 in all specimens. The correlation between NKD1 positive rate， Cyclin D1 positive rate and ectopic expression rate of -catenin was analyzed. Results The positive rate of NKD1 in colorectal cancer tissues （17.71%） was significantly lower than that in normal colorectal mucosa and adenoma respectively （92.59%， 78.95%）， the differences were statistically significant （P < 0.05）； β-catenin protein expression in colorectal cancer tissues （78.13%） and the rate of Cyclin D1 positive rate （84.38%） was significantly higher than that of normal colorectal mucosa， adenoma tissues respectively （42.11%， 34.21%）， the differences were statistically significant （P < 0.05）； the expression of NKD1， β -catenin and Cyclin D1 in colorectal cancer tissues was related to the differentiation degree， Duke stage and lymph node metastasis （P < 0.05）. Conclusion NKD1， β-catenin and Cyclin D1 may be involved in the occurrence， development， invasion and metastasis of colorectal cancer， and the combined detection of the biological behavior of colorectal cancer can be used as a reference for clinical treatment.

[Key words] Colorectal cancer； NKD1； β-catenin ； Cyclin D1

结直肠癌是临床常见恶性肿瘤，在我国具有较高的发病率和死亡率。研究表明，Wnt信号通路异常活化与结直肠癌病变存在紧密关系[1]。裸角质膜同源蛋白（NKD1）、β-连环素（β-catenin）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是Wnt信号通路的重要因子，Wnt异常激活会导致β-catenin异位表达，并在细胞质和细胞核内聚集；NKD1是Wnt信号通路上的重要抑制因子，具有抑制其活化的作用；Cyclin D1则是Wnt信号通路的下游靶基因，具有调控细胞周期的作用[2-3]。本研究采用免疫组化SP法检测NKD1、β-catenin和Cyclin D1在结直肠癌组织中的表达，探讨其在结直肠癌发展过程中的作用，为结直肠癌的诊断和治疗提供临床参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月～2016年1月在鄂东医疗集团黄石市中心医院（以下简称“我院”）行结直肠癌根治术切除的癌症组织标本96例作为癌症组，所有患者术前均未行放化疗，其中男51例，女45例，平均年龄（51.69±8.32）岁，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期51例，Ⅲ+Ⅳ期45例；有淋巴转移60例，无淋巴转移36例。结直肠腺瘤患者切除腺瘤标本38例作为腺瘤组，其中男26例，女12例，平均年龄（50.37±8.28）岁；并从结直肠癌患者中选取27例肠管正常黏膜（距离癌灶>10 cm）作为正常组，其中男14例，女13例，平均年龄（51.19±8.17）岁；所有标本均经高年资病理诊断医师确定诊断。癌症组、腺瘤组、正常组患者的性别、年龄一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属知情并签署同意书。

1.2 检测试剂及方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人NKD1多克隆抗体由美国Santa Cruz公司生产；鼠抗人β-catenin单克隆抗体、兔抗人Cyclin D1单克隆抗体、SP两步法试剂盒、DAB显色试剂盒均由北京中杉金桥公司生产。

1.2.2 检测方法 所有标本采用10%福尔马林溶液充分浸泡、石蜡包埋，4 μm厚连续切片，结肠组织切片常规脱蜡、水化，采用枸橼酸盐缓冲液微波处理进行抗原修复，血清封闭30 min 后分别滴加兔抗人NKD1多克隆抗体（1∶50稀释）、鼠抗人β-catenin单克隆抗体（1∶200稀释）、兔抗人Cyclin D1单克隆抗体（1∶200稀释），4℃孵育过夜，其余步骤严格按照即用型SP免疫组化试剂盒说明书进行，DAB着色、苏木精复染，中性树脂封闭保存[4-7]。阴性对照由美国Santa Cruz公司及北京中杉金桥公司提供，阳性对照采用已知结直肠癌阳性组织。

1.3 结果判断标准

1.3.1 NKD1阳性判读标准 NKD1阳性反应为细胞质出现大小不一的棕黄色或棕褐色颗粒[8-9]。检验结果需要参考染色强度和阳性细胞百分比两个指标。染色强度评分：细胞质内着色强度分为无色、浅棕色、棕黄色、棕褐色，分别对应0～3分。高倍镜下（400×）随机取5个不同视野，计数细胞总数及阳性细胞数，阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞比例≤10%为1分，>10%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。将两项评分相乘所得结果如>3分，则判定NKD1为阳性。

1.3.2 β-catenin异位表达判读标准 β-catenin主要存在于黏膜上皮细胞膜，如出现在细胞质或细胞核中则为异位表达[10-11]。在细胞质或细胞核内以10%作为标准，如>10%则细胞质或细胞核内异位表达，≤10%则为正常，每张切片任意选取10个高倍视野（400×），分别计数100个细胞。

1.3.3 Cyclin D1阳性判读标准 Cyclin D1阳性表达为细胞核出现大小不一的棕黄色或棕褐色颗粒[12-13]。检验结果需要参考染色强度和阳性细胞百分比两个指标。染色强度评分：细胞质内着色强度分为无色、浅棕色、棕黄色、棕褐色，分别对应0～3分。高倍镜下（400×）隨机取5个不同视野，计数细胞总数及阳性细胞数，阳性细胞百分比评分：阳性细胞比例≤10%为0分，阳性细胞比例>10%～45%为1分，>45%～70%为2分，>70%为3分。将两项评分相乘所得结果如>3分，则判定Cyclin D1为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，计数资料采用百分比，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NKD1、β-catenin和Cyclin D1在不同组别组织中的表达情况

NKD1在正常组织、腺瘤组织、癌症组织中的阳性表达率依次降低，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05），但正常组与腺瘤组之间的阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；β-catenin和Cyclin D1在正常组织、腺瘤组织、癌症组织中的阳性表达率依次上升，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 NKD1、β-catenin和Cyclin D1表达与结直肠癌临床病理特征的关系

结直肠腺癌组织中的NKD1阳性表达、β-catenin异位表达和Cyclin D1阳性表达与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移相关（P < 0.05），与性别、年龄、肿瘤直径、病变部位等因素无关（P > 0.05）。见表2。

2.3 NKD1、β-catenin和Cyclin D1之间的相关性

在结直肠腺癌组织中NKD1的阳性率和β-catenin异位表达率呈负相关（r=-0.546，P < 0.05）；β-catenin异位表达率与Cyclin D1阳性率呈正相关（r=0.672，P < 0.05）；NKD1的阳性率和Cyclin D1阳性率无相关性（r=0.013，P > 0.05）。

3 讨论

NKD1是Wnt信号通路上重要的抑制蛋白，普遍存在于正常组织中，与多种肿瘤存在密切关系。NKD1中的活性结构位点EF-Hand与Dvl的PDZ区域相结合，使得散乱蛋白含量降低，抑制了经典Wnt/β-catenin信号途径激活[14]。同时NKD1还可以激活c-JNK调节Wnt/PCP信号通路，从而影响上皮细胞的积极性，调节黏附蛋白的活动，最终抑制肿瘤的增殖[12]。本研究结果显示，结直肠癌组织中的NDK1阳性表达率明显低于正常组织和腺瘤组织，使其无法抑制Wnt通路激活，导致β-catenin进入细胞质或细胞核，促使肿瘤转移和侵袭[15]。本研究结果表明，NDK1与肿瘤的TNM分期、分化程度、淋巴结转移相关。

β-catenin蛋白在Wnt信号通路中具有激活通路和抑制癌细胞侵袭的双重作用。正常细胞中的β-catenin蛋白与细胞膜上的钙黏蛋白、轴蛋白结合，形成降解复合物，而很少进入到细胞质中[16]。但是当Wnt异常被激活时，β-catenin蛋白的降解过程会受到抑制，β-catenin蛋白进入细胞质或细胞中，与TCF/LEF结合成复合体，并激活通路下游的靶基因，导致细胞异常增殖，从而导致癌变[17]。β-catenin与细胞膜上的钙黏蛋白结合，能够维持细胞黏附，当β-catenin减少时，这种黏附作用降低，导致癌细胞的侵袭力增强，加快了癌细胞扩散。本研究结果表明，结直肠癌组织中的β-catenin异常表达率明显高于正常组织和腺瘤组织，且与肿瘤的TNM分期、分化程度、淋巴结转移相关，提示β-catenin蛋白可能参与了结直肠癌的恶性表现，并促进了癌细胞的转移和分化，可作为评估肿瘤预后的预测因素。

Cyclin D1蛋白是周期素蛋白家族的重要成员，其重要功能就是促进细胞增殖。通过激活依赖性激酶CDK4，使得G1期周期抑制蛋白（Rb）被磷酸化，CDK4对Rb蛋白调节失常，导致细胞失控性生长，从而使得细胞周期由G1期加速进入S期[18]。本研究结果表明，在结直肠癌组织的Cyclin D1阳性率明显高于正常组织和结直肠腺瘤组织，与任斐等[19]的研究结果一致。同时，结直肠癌组织中的Cyclin D1蛋白阳性率与肿瘤的TNM 分期、分化程度、淋巴结转移相关。

NKD1、β-catenin和Cyclin D1三种Wnt信号通路的成员蛋白在结直肠癌的发生、发展过程中相互作用[20]。本研究结果表明，NKD1与β-catenin呈负相关，NDK1可以阻止β-catenin向细胞核内积聚，从而影响β-catenin表达，维持通路中各分子平衡。β-catenin与Cyclin D1呈正相关，β-catenin异位表达率升高时，导致受β-catenin调控的核内癌基因转录活性增强，同时Cyclin D1的阳性表达率升高。

综上所述，NKD1的失表达、β-catenin异位表达和Cyclin D1的高表达在结直肠癌组织中同时存在，并均与肿瘤的TNM 分期、分化程度、淋巴结转移相关，因此联合检测NKD1、β-catenin和Cyclin D1对于判断结直肠癌的生物学行为，预测癌症发展、转移及预后有一定的临床价值。

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（收稿日期：2016-06-12 本文编辑：王红双）