甘蔗叶堆肥中3种常用杀菌剂的降解动态研究

刘景坤 贾明明 武春媛 邓晓 邹雨坤 李怡 李勤奋

摘 要 為杀灭甘蔗叶残留病原菌且不对农田土壤造成药害，实现甘蔗叶的健康安全还田，开展了甘蔗叶堆肥中常用3种杀菌剂残留动态研究。选择多菌灵、戊唑醇、吡唑醚菌酯3种常用杀菌剂添加到甘蔗叶堆肥中，设置3个浓度5、20、50 μg/g，分别在40、50、60 ℃下进行堆肥；首先优化液质联用参数，建立3种杀菌剂同时检测的方法，然后对降解动态进行研究。结果表明，3种杀菌剂在0.005～0.2 μg/mL范围内线性关系良好，R2>0.999，0.1、2.0、40.0 μg/g 3个浓度水平的加标回收率均在80%～105%之间，RSD<10%，方法准确性和精密度良好。相同初始添加浓度时，3种杀菌剂在40 ℃时降解最快，表现为40 ℃>50 ℃（60 ℃）；同等温度下，当初始添加量增加时，降解速率减慢，相同初始添加浓度下降解速率随温度变高先减慢后加快；改变初始添加量对降解速率的影响更大。多菌灵降解速率明显快于其他两种杀菌剂，初始添加浓度20 μg/g时半衰期为18 d左右，可以添加用来堆肥杀菌；戊唑醇和吡唑醚菌酯初始添加浓度20 μg/g时半衰期大于50 d。

关键词 甘蔗叶堆肥；杀菌剂；降解动态；液质联用

中图分类号 S481.8 文献标识码 A

The Degradation Dynamics of Three Types of

Common Fungicides in Sugarcane

Leaves Composting

LIU Jingkun1，2， JIA Mingming1，3， WU Chunyuan1，2， DENG Xiao1，2，

ZOU Yukun1，2， LI Yi1，2， LI Qinfen1，2 *

1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Danzhou Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan， 571737， China

3 Huazhong Agriculture University， Wuhan， Hubei 430070， China

Abstract The degradation dynamic of three types of common fungicides in sugarcane was researched in order to return sugarcane leaves to soil safely after the pathogen in the leaf was killed. Three concentration levels of the pesticides including carbendazim， tebuconazole and pyraclostrobin 5 μg/g， 20 μg/g and 50 μg/g were added in the compost and incubated at the temperature 40 ℃， 50 ℃ and 60 ℃， repeated three times. The degradation dynamics were researched after the detection method was developed. The results showed that the standard calibration curves with R2 more than 0.999 were developed， which showed good linear relationship from 0.005 μg/mL to 0.2 μg/mL. The results of spiked recovery in the range 80%-105% with the RSDs less than 10% in the level 0.1 μg/g，2.0 μg/g and 40.0 μg/g showed the good accuracy and precision. At the same initial concentrations， the pesticides at 40 ℃ had the most rapid degradation than that under 50 ℃ and 60 ℃. At the same temperature the higher concentration pesticides had a less rapid degradation rate and at the same concentration， there was a slower degradation rate at first and more rapid later on with the temperature rise from 40 ℃ to 60 ℃. The change of initial concentration gave the degradation greater effects. The carbendazim with the shortest half-life in the sugarcane leaves composting left half only 18 days later under 50 ℃， which was suitable for killing pathogens. On the other hands， the half-life of tebuconzole and difenoconazole was more than 50 days when the initial concentration was 20 μg/g.

Key words sugarcane leaves composting； fungicide； degradation dynamic； LC-MS/MS

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.023

甘蔗（Saccharum officenarum L.）是我国重要的经济作物，是重要的糖料和能源作物，在南方热区广泛种植。甘蔗收获后叶子通常是丢弃或者焚烧处理，不仅造成资源浪费和污染环境，还易引发火灾，存在安全隐患。将甘蔗叶堆肥后还田是一种节约资源，改善土壤质地的有效方式，但还田蔗叶中的多种病原菌有利于病害的传播和爆发，因此有必要采取适当的方式在还田之前对病原菌进行杀灭，实现健康还田。在甘蔗叶堆肥中添加适量的常用杀菌剂能够杀灭病原菌，减轻甘蔗病害发生，实现甘蔗叶的健康安全还田。

甘蔗种植过程中常见的病害主要有黑穗病、凤梨病、梢腐病等[1-2]，多菌灵、戊唑醇、吡唑醚菌酯等杀菌剂是防治甘蔗病害的常用药[3-6]，这几种农药在其他作物病虫害防治中的降解动态已有报道[7-10]，但在甘蔗叶堆肥中的残留动态研究未见报道，而且农药残留在土壤以及作物中的降解动态相比于堆肥中，光照、温度、湿度、与外界气体交换等各种条件均差异较大，可以参考的文献较少，因此，笔者对3种常用杀菌剂在甘蔗叶堆肥中的残留动态进行了研究，以期为甘蔗叶堆肥安全还田提供可行的技术方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品及试剂 98%多菌灵原药、98%吡唑醚菌酯购自百灵威公司，乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）购自美国Fisher公司，99%戊唑醇原药、氨水和甲酸购自阿拉丁公司，固相萃取（SPE）柱、PSA净化管购自美国Agilent公司，氯化钠、无水硫酸镁等均为分析纯购自国药公司化学试剂厂，超纯水为自制，甘蔗叶收集自实验基地晒干打碎后使用。

1.1.2 仪器 液质联用仪（TQS-Micro，美国Waters公司），超声波清洗器（T18，德国IKA公司），旋转蒸发仪（R-215，瑞士Buchi公司）。

1.2 方法

1.2.1 3种杀菌剂检测方法 采用超声提取、PSA净化管的方法进行净化，优化液相色谱-质谱联用法参数建立同时检测发酵甘蔗叶中3种杀菌剂含量的方法。

（1）3种杀菌剂定量、定性离子的选择及参数优化。采用直接进样方式选择3种杀菌剂响应值最强的离子为定量离子，次强的为定性离子，多菌灵、戊唑醇、吡唑醚菌酯的定量离子分别为160、308、296，定性离子分别为192、70、194；并对其进行参数优化，使相应强度达到最高值水平，结果如表1所示。

（2）液相及质谱条件。3种杀菌剂使用液质联用同时检测，流动相为乙腈和水（0.05%氨水，0.01%甲酸），流速为0.4 mL/min，HSS C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），采用梯度洗脱方式进行（表2）；质谱采用多反应监测（MRM）模式进行，使用电喷雾离子源，毛细管电压均为+3 200 V，雾化气压力103.425 kPa，干燥气温度350 ℃，干燥气流速800 L/h。

（3）标准校正曲线建立。使用MRM方式进行扫描，外标法进行定量，建立3种杀菌剂的标准校正曲线，标液系列浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μg/mL。

（4）提取与净化。称取10.0 g样品，加入80.0 mL乙腈为提取溶剂，超声提取30 min，过滤至含有6.0 g氯化钠的具塞试管中，加塞密閉后剧烈震荡1 min，静置分层后取上清加入PSA净化管（PSA+无水硫酸镁），摇匀后取上清并加入等体积的水，过0.22 μm膜，上机检测。

（5）加标回收试验。取10.0 g空白样品，加入3种杀菌剂的母液，根据降解初始阶段和降解率达到90%时的理论浓度水平，使其最后浓度分别为0.1、2.0、40.0 μg/g，静置3 h后按上述步骤提取与净化步骤处理，最后加入乙腈/水（V/V=1 ∶ 1）进行稀释，用标曲进行标定，计算加标回收率，每个浓度水平3个重复。

1.2.2 3种杀菌剂在甘蔗叶堆肥中的降解 根据已有甘蔗叶的碳氮比数据，将粉碎的甘蔗叶加入溶解有尿素的纯水，使碳氮比达到30、水分含量为60%有利于发酵，设置3个培养温度，40、50、60 ℃，3个初始添加浓度5、20、50 μg/g，进行避光培养，定期取样分析，使降解率在20%～80%之间至少有6个检测点。

2 结果与分析

2.1 检测方法的建立

2.1.1 3种杀菌剂的质谱图 采用梯度洗脱的方式和优化的质谱参数进行分析，建立3种杀菌剂在甘蔗叶堆肥中同时检测的方法，定量离子流和定性离子流图如图1，分离度高，峰形良好，能准确积分。

2.1.2 3种杀菌剂的校准曲线 采用MRM（多反应监测模式）进行扫描，外标法进行定量，得到3种杀菌剂的标准校正曲线，3种杀菌剂在0.005～0.2 μg/g范围内线性关系良好，R2均超过0.999（图2）。

2.1.3 加标回收率试验 0.1、2.0、40.0 μg/g 3个浓度水平加标能够代表3个初始添加量及降解过程中杀菌剂残留的浓度水平，按照前处理步骤使用优化的检测方法，所得回收率如表3所示。3个添加浓度水平的回收率位于80%～100%之间，其中0.1 μg/g添加水平的回收率相对较高，位于95%～100%之间，方法整体准确度较高，满足农残检测有关加标回收率的要求。

2.2 降解动态

样品的不同培养温度，杀菌剂的不同初始添加浓度下的降解半衰期不同[11-16]（表4）。从表4明显可以看出，多菌灵较戊唑醇和吡唑醚菌酯的降解周期短，40 ℃时初始添加量为5 μg/g时，多菌灵半衰期为7.7 d，吡唑醚菌酯半衰期为17.8 d，而戊唑醇半衰期为26.3 d；初始添加量为20、50 μg/g时，多菌灵半衰期分别为14.8、17.7 d，吡唑醚菌酯和戊唑醇半衰期均超过50 d。增加初始温度到50 ℃时3种农药半衰期略有增加，增加到60 ℃时，半衰期比50 ℃略有缩短。增加初始浓度，3种农药半衰期均增长，增加到20 μg/g以上时，戊唑醇和吡唑醚菌酯半衰期都超过了50 d，增加幅度较为明显。说明温度和初始添加量对3种杀菌剂的降解周期均有较大影响。

2.2.1 不同温度下的降解动态 杀菌剂在样品体系中的降解主要有微生物降解、水解等，受微生物数量、温度等因素的影响。多菌灵初始添加量为5 μg/g时，40 ℃时半衰期为7.7 d，较50 ℃时降解快，60 ℃时半衰期为7.1 d。在较低添加量时，40 ℃较适宜微生物的生长繁殖，增加了微生物的数量，较50 ℃时降解快，60 ℃时与50 ℃时相比，虽然温度升高微生物生长受到抑制但水解等化学因素的降解逐渐加快，使得半衰期变短；戊唑醇和吡唑醚菌酯在添加量较低时具有相同趋势，初始添加量较高时戊唑醇和吡唑醚菌酯整体降解都很慢。

2.2.2 不同初始浓度下的降解动态 3种杀菌剂在高添加浓度时明显较低添加浓度时降解周期长。40 ℃时，多菌灵在初始添加量为5 μg/g时半衰期为7.7 d，20、50 μg/g时则分别为14.8、17.7 d；同样，戊唑醇和吡唑醚菌酯初始添加量为20、50 μg/g时半衰期过长（实验期限内无法获得），明显较添加量为5 μg/g时半衰期长。分析是杀菌剂初始添加量增加时，微生物繁殖受到抑制，微生物降解速率变慢所致。

3 讨论

超声和匀浆是农药提取时常用的2种方法，相对于匀浆提取，超声法具有能够一次提取批量样品，提取效率高；不用人员操作，对分析检测人员毒性较小；不用清洗匀浆器，不会产生交叉污染等诸多优点。因此，完全能够取代匀浆提取。PSA净化相对于传统的固相萃取小柱不用经过活化淋洗等诸多步骤、加快了净化速度、减少了有机溶剂使用种类、降低了对分析检测人员危害，因此，采用超声提取加PSA净化方法进行前处理。

文献[17-22]报道的关于农药残留的降解以及在作物中的降解动态，如光解、水解、土壤降解等均符合一级动力学方程，均是在自然状态或接近自然状态下进行，而且因素之间互作较少；在甘蔗叶中进行发酵，温度湿度相对较高，对微生物生长和种群数量产生影响，发酵空间密闭，空气消耗和农药添加浓度对微生物均会产生不同于降解动态研究中的影响，而且微生物的生长繁殖和种群数量的变化也会对农药的降解速率产生影响。

相同的农药初始添加量、样品量及相同的培养条件时，如果只有热量和水分等因素的影响，根据化学反应随温度升高而加快的规律，几种杀菌剂理论降解速率应为60 ℃>50 ℃>40 ℃，与实验结果为40 ℃>50 ℃（60 ℃）不相符，说明除了化学降解外还存在别的因素，生物因素是其中最重要的一个方面[22-26]，推测原因是40 ℃时微生物代谢繁殖最为旺盛，种群数量增加加快了降解过程，50 ℃和60 ℃时微生物生长繁殖受到抑制，降解速率变慢。相同温度下，药剂初始添加浓度越高降解速率越慢，推测原因是添加浓度过大导致微生物的生长受到农药的抑制，降低了降解速率。与作物生产时喷施的农药处于自然状态下不同[11-16]，堆肥在密闭环境中，而且温度与自身体系有关，与外界不一致，微生物、农药、温度之间存在相互影响，降解不符合一级动力学。

虽然3种药剂对甘蔗病害均有较好的防治效果[3-6]，但是降解速率差别较大，甘蔗叶堆肥过程中温度一般在50 ℃左右，多菌灵初始添加浓度20 μg/g时半衰期18 d左右，至堆肥完成农药降解至较低浓度水平，可以添加用来堆肥杀菌；戊唑醇和吡唑醚菌酯初始添加浓度20 μg/g时半衰期大于50 d，堆肥中会有较大浓度的殘留。所以，在堆肥中需要选择合适的农药种类以及添加合适浓度的农药用来灭菌，才能保证在堆肥完成后肥料中的农药残留完全降解或者降解到很低水平，以免造成药害或者加重农田环境污染。

堆肥持续时间约50 d，温度50 ℃左右，使用多菌灵降解最快，至堆肥结束，肥料中残留的农药含量水平低，还田不会造成污染。

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