猪圆环病毒2型体外诱导RAW264.7细胞氧化应激模型的建立

杨剑　尹丹　郝祝兵　谭红连　韦英益　曾芸　胡庭俊

摘要：【目的】探讨猪圆环病毒2型（PCV2）感染量、感染时间与被感染RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性，为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据。【方法】PCV2原液调至5×106/mL，经10、102、103和104倍稀释（10-1、10-2、10-3和10-4稀释度）后，感染作用RAW264.7细胞2 h，弃病毒液，加入含5% FBS的DMEM培养液继续培养，分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞，测定一氧化氮（NO）、活性氧自由基（ROS）、还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、髓过氧化物酶（MPO）和诱生型一氧化氮合酶（iNOS）等指标。【结果】10-1 PCV2感染RAW264.7細胞后能有效升高细胞NO、ROS水平，降低细胞GSH水平和GSH/GSSG，升高细胞XOD、MPO和iNOS活性，表明以10-1 PCV2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态，诱导细胞产生氧化应激。【结论】PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激，并确立10-1 PCV2（5×105/mL）体外感染RAW264.7细胞4～24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件。

关键词： 猪圆环病毒2型（PCV2）；RAW264.7细胞；氧化应激；模型

中图分类号： S858.28 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0151-07

Abstract：【Objective】The present study investigated the relationship between infection dose， infection time of porcine circovirus type 2（PCV2） and dynamic changes of reactive oxygen species（ROS） levels in PCV2 infected RAW264.7 cells， so as to provide a reference for the establishment of in vitro oxidative stress model of RAW264.7 cell. 【Method】 PCV2 virus liquid of 5×106/mL was prepared， and was 10， 102， 103 and 104 times diluted（10-1， 10-2， 10-3， 10-4 dilutions） before use. RAW264.7 cells were infected with five different concentrations of PCV2 for 2 hours， and then virus liquids were discarded. The cells were cultured in DMEM after adding 5% FBS for 4， 8， 12， 24 and 48 h. Cell supernatant or cells were collected and levels of nitric oxide（NO）， reactive oxide species（ROS）， reduced glutathione（GSH）， oxidized glutathione（GSSG）， xanthine oxidase（XOD）， myeloperoxidase（MPO） and inducible nitric oxide synthase（iNOS） were determined. 【Result】After 10-1 PCV2 infected RAW264.7 cells， levels of NO and ROS increased while GSH levels and GSH/GSSG ratio decreased. Activities of XOD， MPO and iNOS also increased. These findings suggested that 10-1 PCV2 infection could change cellular redox state and induce cells to produce oxidative stress. 【Conclusion】PCV2 infection can induce oxidative stress in RAW264.7 cells. 10-1 PCV2（5×102/mL） infection in vitro on RAW264.7 cells for 4-24 h is the optimum condition for establishing oxidative stress model.

Key words： porcine circovirus type 2（PCV2）； RAW264.7 cell； oxidative stress； model

0 引言

【研究意义】猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning mutisystenic wasting syndrome，PMWS）的主要致病原，给全球养猪业带来了巨大经济损失（Jiang et al.，2012；杨利勇等，2015）。PCV2复制的主要场所是单核—巨噬细胞和抗原提呈细胞，从其感染病猪的肺脏、肝脏、肾脏、扁桃体、胸腺、外周血单核细胞、支气管淋巴结、腹股沟淋巴结中均能检测到PCV2（Yu et al.，2007），即造成病猪免疫系统受损、免疫能力下降。动物机体的氧化还原状态与机体疾病的发生和发展存在密切联系。氧化应激是指动物机体在遭受内源性或外源性有害刺激时，机体高活性分子如活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）产生过多，氧化程度超过机体自身清除氧化性物质的能力而导致组织损伤（吕进和王希良，2009）。因此，加强PCV2感染所致免疫细胞氧化应激模型研究对揭示其致病机理具有重要意义。【前人研究进展】近年来，不同细胞氧化应激模型的研究逐渐增多。赵曙光等（2011）在研究不同浓度葡萄糖氧化酶（GO）对人类肝细胞L02氧化应激水平的影响时，发现GO引起的肝细胞氧化应激损伤呈剂量依赖性，其中100 U/L是建立肝细胞氧化应激的适宜浓度。齐晓龙等（2013）以不同浓度过氧化氢（H2O2）作用产蛋鸡肝细胞1、2、4 h和24 h后，测定肝细胞的相对存活率、胞内丙二醛（MDA）和ROS含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，结果发现以4 mmol/L H2O2处理肝细胞2 h可构建产蛋鸡原代肝细胞氧化应激模型。杨玉霞等（2015）成功建立了体外叔丁基过氧化氢小梁网细胞氧化应激模型，可应用于青光眼氧化应激研究。有关病毒感染所致细胞氧化应激模型的建立也有报道，如Chen等（2012）研究发现，PCV2感染PK-15细胞能促进ROS产生，诱导细胞产生氧化应激，而ROS的产生反过来促进PCV2复制，表明PCV2在感染宿主细胞及复制的过程中会破坏细胞氧化还原状态平衡，而宿主细胞氧化还原状态的改变又能影响病毒的感染和复制。至今，国内外关于PCV2实验性感染BALB/c小鼠、昆明系小鼠模型的研究逐渐增多。Kiupel（2001）、Quintana等（2002）、赵路易等（2007）、罗玉均等（2008）先后通过腹腔注射PCV2感染BALB/c小鼠，在其血清、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织均成功检测到PCV2。苗岚飞等（2008）、Li等（2010）、Deng等（2011）、邓治邦等（2012）以PCV2感染昆明小鼠后，在感染昆明小鼠的多个脏器内均可检出PCV2，成功构建了PCV2感染昆明系鼠模型。此外，Cságola等（2008）、Opriessnig等（2009）研究表明，在PCV2实验性感染不同品系小鼠血液中能检测到PCV2，但感染小鼠未表现出任何病理变化。【本研究切入点】PCV2实验性感染仔猪的研究已取得一定进展，有关PCV2与其他病原微生物（猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪细小病毒等）混合感染建立感染动物模型的报道也较多（Okuda et al.，2003；Opriessnig et al.，2004；Lager et al.，2007），但单一利用PCV2感染复制出PMWS的研究鲜见报道，尤其关于PCV2感染所致免疫细胞氧化应激模型的建立尚无报道。【拟解决的关键问题】通过PCV2体外感染小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞，测定感染细胞分泌一氧化氮自由基（NO）的水平、细胞内总活性氧（ROS）水平、还原型谷胱甘肽（GSH）含量、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量、黄嘌呤氧化酶（XOD）活性、髓过氧化物酶（MPO）活性、诱生型一氧化氮合酶（iNOS）活性，旨在探讨PCV2感染量、感染时间与RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性，为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

PCV2 SH毒株由南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室提供，经PK-15细胞增殖后测得病毒滴度为104 TCID50/0.1 mL；PCV2特异性引物采用Primer Premier 5.0进行设计，由Invitrogen公司合成。猪肾传代细胞系PK-15细胞由广西大学动物科学技术学院预防兽医学教研室提供，RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库，南美洲胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培养液购自美国Gibco公司，病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，XOD、MPO、iNOS活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，噻唑蓝（MTT）、邻苯二甲醛（OPT）、还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）购自北京索莱宝科技有限公司，萘乙烯二胺购自国药集团化学试剂有限公司，对氨基苯磺酸购自天津市福晨化学试剂厂。主要仪器设备有UV1750型紫外可见光分光光度计、Multimode Plate Reader多功能酶标仪、S1000梯度PCR仪、C150细胞培养箱、TS100-F倒置显微镜等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 细胞分离培养及处理 RAW264.7细胞复苏后用含10% FBS的DMEM培养液转入瓶中，于37 ℃、5% CO2培养箱中进行传代培养，调节细胞浓度至1×106/mL铺于24孔板（1.0 mL/孔），37 ℃、5% CO2培养贴壁后弃上清液，加入PCV2 200 μL，于37 ℃、5% CO2下再孵育2 h，PBS洗涤2次，加入含10% FBS的DMEM培养液分别培养4、8、12、24和48 h。细胞处理结束后弃上清液，PBS洗涤3次，收集细胞，严格按照试剂盒说明提取DNA，并以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 2. 2 试验分组及处理 分别设细胞对照组和5个不同浓度（100、10-1、10-2、10-3和10-4稀释度）PCV2感染组。病毒原液调至5×106/mL，分别进行10、102、103和104倍稀释。细胞对照组加入无血清DMEM培养液200 μL，各病毒组加入等量不同浓度病毒液，于37 ℃、5% CO2培养箱中吸附2 h，弃病毒液，PBS洗涤3次后每孔加入1.0 mL含5% FBS的DMEM培养液继续培养，分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞，用于NO、ROS、GSH、GSSG、XOD、MPO和iNOS等指标测定。

1. 2. 3 MTT法检测细胞活性 细胞培养44 h后吸出110 μL上清液，加入10 μL的5 g/L MTT继续培养，4 h后弃上清液，加入100 μL DMSO，室温避光静置10 min，酶联免疫检测仪检测OD450 nm。

1. 2. 4 Griess法检测上清液中NO含量 细胞分别培养4、8、12和24 h后，收集细胞上清液（100 μL），加入100 μL Griess试剂，室温避光反应10 min，酶联免疫检测仪检测OD450 nm，根据NaNO2标准曲线计算NO含量。

1. 2. 5 DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平 细胞分别培养4、8、12、24和48 h后，弃上清液，每孔加入0.5 mL的10 μmol/L DCFH-DA荧光探针，孵育30 min后弃上清液，PBS洗涤3次，加入1.0 mL PBS，收集细胞200 μL于96孔黑板中，于荧光酶标仪测定荧光值（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

1. 2. 6 OPT荧光法检测细胞内氧化还原状态 分别于细胞处理4、8、12、24和48 h后收集细胞，加入400 μL的5%三氯醋酸，冰水浴超声破碎1 min，于4 ℃下12000×g离心15 min，取上清液分装，-80 ℃保存。GSH测定：取200 μL上清液加入3.6 mL PBS-EDTA（pH 8.0）和200 μL OPT，混匀，室温孵育40 min，于荧光酶标仪测定荧光值（激发波长350 nm，发射波长425 nm），并根据标准曲线计算GSH含量。GSSG测定：取100 μL上清液加入40 μL NEM（0.04 mol/L）室温孵育30 min，再加入1.9 mL NaOH（0.1 mol/L）和100 μL OPT（1 mg/mL），混勻，室温孵育15 min，于荧光酶标仪测定荧光值（激发波长337.8 nm，发射波长421.6 nm），并根据标准曲线计算GSSG含量。

1. 2. 7 细胞内XOD、MPO及iNOS活性检测 分别于细胞处理4、8、12、24和48 h后弃上清液，收集细胞，2000×g离心5 min，弃上清液，PBS洗涤3次，再加入0.5 mL PBS，超声破碎后10000×g离心10 min，取上清液，严格按照测定试剂盒说明进行XOD、MPO及iNOS活性检测。

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 18.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 PCV2感染RAW264.7细胞的结果

图1显示，PCV2感染RAW264.7细胞4、8、12、24和36 h后，抽提病毒DNA，经PCR扩增均能得到特异性条带，感染后48 h所得特异性条带较弱，而感染后2和72 h未能扩增获得特异性条带。说明PCV2能成功感染RAW264.7细胞，但感染时间宜控制在4～36 h。

2. 2 PCV2感染对RAW264.7细胞活性的影响

如图2所示，PCV2原液感染RAW264.7细胞能极显著降低细胞活性（P<0.01，下同），其余各浓度的PCV2感染RAW264.7细胞活性也有一定程度的降低，但与细胞对照组相比差异不显著（P>0.05，下同）。

2. 3 PCV2感染RAW264.7细胞对NO分泌的影响

如图3所示，不同浓度PCV2感染RAW264.7细胞后，随着感染时间的延长细胞分泌NO水平逐渐升高，其中10-1 PCV2感染RAW264.7细胞24和48 h后细胞分泌NO水平较细胞对照组显著升高（P<0.05，下同）。表明PCV2感染RAW264.7细胞能促进其分泌NO。

2. 4 PCV2感染RAW264.7细胞对ROS产生的影响

如图4所示，PCV2感染RAW264.7细胞24 h内，ROS水平随感染时间的延长呈逐渐升高趋势，但至感染后48 h时显著降低。以10-1 PCV2感染RAW264.7细胞后，其细胞内ROS水平在各时间点均显著高于细胞对照组。

2. 5 PCV2感染RAW264.7细胞对细胞内氧化还原状态的影响

如图5-A所示，PCV2感染RAW264.7细胞能降低其细胞内GSH水平。其中，10-1 PCV2感染RAW264.7细胞8、12和24 h后能有效降低细胞内GSH水平，与细胞对照组的差异极显著；10-2 PCV2感染RAW264.7细胞8和24 h后细胞内GSH水平也极显著低于细胞对照组，感染后12 h细胞内GSH水平显著低于细胞对照组。

如图5-B所示，PCV2感染RAW264.7细胞后整体上有助于升高其细胞内GSSG水平。 其中，PCV2原液感染RAW264.7细胞除在感染4 h后的细胞内GSSG水平低于细胞对照组外，其他时间点均高于细胞对照组，且在感染后8和12 h时极显著高于细胞对照组，感染后48 h时显著高于细胞对照组；10-1 PCV2感染RAW264.7细胞4、8和12 h后能有效升高细胞内GSSG水平，与细胞对照组的差异极显著，感染24 h后细胞内GSSG水平仍显著高于细胞对照组。

如图6所示，PCV2感染RAW264.7细胞能降低细胞内GSH/GSSG。其中，PCV2原液感染RAW264.7细胞8、12和24 h后细胞内GSH/GSSG极显著低于细胞对照组；与细胞对照组相比，10-1 PCV2、10-2 PCV2和10-3 PCV2感染RAW264.7细胞12和24 h后均能极显著降低感染细胞内GSH/GSSG。

2. 6 PCV2感染RAW264.7对XOD活性的影响

如图7所示，PCV2感染RAW264.7细胞后整体上有提高细胞XOD活性的趋势。其中，PCV2原液感染RAW264.7细胞12和24 h后细胞XOD活性显著高于细胞对照组；10-1 PCV2感染RAW264.7细胞8、12、24和48 h后细胞XOD活性显著或极显著高于细胞对照组。

2. 7 PCV2感染RAW264.7细胞对MPO活性的影响

如图8所示，PCV2感染RAW264.7细胞后能有效提高细胞MPO活性，但随着培养时间的延长细胞MPO活性整体上呈逐渐降低趋势。其中，PCV2原液感染RAW264.7细胞后细胞MPO活性显著高于细胞对照组，且在感染4 h时差异达极显著水平；10-1 PCV2感染RAW264.7细胞后的MPO活性在感染后8 h时极显著高于细胞对照组，其他时间点则显著高于细胞对照组。

2. 8 PCV2感染RAW264.7细胞对iNOS活性的影响

如图9所示，PCV2感染RAW264.7细胞后整体上能提高细胞iNOS活性，且以10-1 PCV2感染RAW264.7细胞的提高效果最明显，各时间点的感染细胞iNOS活性均显著或极显著高于细胞对照组。

3 讨论

病毒感染是引发多种动物疾病的直接原因，与自由基堆积导致的氧化损伤密切相关。一方面，病毒感染引起细胞ROS累积，促使吞噬细胞活化并释放氧化性细胞因子，如TNF和IL-1等（吕进和王希良，2009）。已有研究表明，许多病毒都能引起多种细胞大量释放ROS（刘倩等，2011），包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人体免疫缺损病毒、呼吸道合胞病毒和流感病毒等。另一方面，病毒感染产生的ROS在疾病进程中能激活动物机体的免疫系统，在对抗细胞损伤方面起正调节作用（Gruhne et al.，2009）。在正常生理条件下，动物机体通过维持氧化物/抗氧化物的平衡以保持体内的正常状态，病毒感染时，病毒通过改变细胞氧化物与抗氧化物的平衡，影响细胞凋亡过程，从而引起机体状态的改变。Lim等（2002）研究发现，疱疹病毒感染可引起機体SOD水平下降、NO水平明显升高，表明病毒感染诱导宿主细胞产生氧化应激，释放大量自由基，在自由基的作用下病毒复制增强。Chen等（2012）研究表明，PCV2体外感染RAW264.7细胞能显著升高细胞内ROS水平及NO分泌水平，降低GSH水平，诱发细胞氧化应激。Bottero等（2013）研究表明，疱疹病毒感染能使细胞产生ROS放大信号通路而有利于病毒侵入细胞。可见，不同动物、免疫细胞氧化应激模型的建立是研究病毒感染与氧化应激、活性氧间关系的重要途径，同时可为开发缓解病毒感染所致氧化应激的药物提供理论依据。

RAW264.7细胞作为小鼠的巨噬细胞系，已广泛应用于病毒感染研究（Huang et al.，2008；Hangdo et al.，2011；Lin et al.，2012；Cline et al.，2013）。本研究中，PCV2成功感染RAW264.7细胞，与Su等（2013）的研究结果一致，且在感染初期（4 h）就对RAW264.7细胞造成影响，感染4～36 h均能通过PCR扩增获得PCV2特异性条带；但值得注意的是从48 h开始，其特异性条带亮度较弱，至72 h时肉眼已经无法分辨，因此选择4～48 h作为后续研究的时间范围。通过观察PCV2感染RAW264.7细胞后细胞NO、ROS、GSH、GSSG水平及MPO、XOD、iNOS活性的变化规律，结果发现，10-1 PCV2感染RAW264.7细胞后能有效升高其NO、ROS水平，降低细胞GSH水平和GSH/GSSG，升高细胞XOD、MPO和iNOS活性，表明10-1 PCV2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态，诱导细胞产生氧化应激。

病毒感染引起ROS释放，当ROS水平超出机体或细胞的清除能力时，即导致损伤（施志慧等，2012）。本研究结果表明，PCV2原液（5×106/mL）对氧化应激模型的建立不如10-1 PCV2（10倍稀释），其原因可能是高滴度的PCV2感染RAW264.7细胞后，细胞释放过多的ROS，虽然已发生氧化应激，但过多的ROS超出了细胞的氧自由基清除能力，最终导致细胞损伤，而不利于氧化应激模型建立。同时，本研究发现在4～24 h范围内，ROS、GSH、GSH/GSSG、XOD、iNOS等指标随着感染时间的延长呈不同程度的上升趋势；但超过24 h后（48 h）出现急剧下降。结合PCV2特异性条带检测结果：在感染4～36 h范围内能检测到PCV2特异性条带，但至48 h时其特异性条带亮度较弱，至72 h时肉眼观察已无法分辨。因此，推测核酸病毒的强弱与表征氧化应激水平的各指标间存在一定关联：核酸病毒的强弱或有无能间接反映PCV2感染的成功与否，在感染后48 h时核酸条带较弱，说明PCV2感染RAW264.7细胞程度低；感染48 h后ROS、GSH、GSH/GSSG、XOD、iNOS等指标的急剧下降则进一步说明病毒感染程度越高，其氧化应激水平越高，但时间并不是病毒感染程度的衡量指标。

4 结论

PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激，并确立10-1 PCV2（5×105/mL）体外感染RAW264.7细胞4～24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件。该模型可进一步应用于PCV2感染与RAW264.7氧化应激相关的研究，为揭示PCV2感染机制和治疗方法研究打下基础。

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（責任编辑 兰宗宝）