水杨酸对铜绿微囊藻的化感抑制作用

胡利静　童桂香　黄光华　肖艳翼　刘腾飞　胡鲲　杨先乐　韦信贤

摘要：【目的】探讨外源水杨酸对铜绿微囊藻生长及光合系统的影响，为将水杨酸应用于除藻剂研发提供参考依据。【方法】通过人工培养的方法，利用分光光度计和各类试剂及试剂盒等对经不同浓度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12 g/L）水杨酸处理铜绿微囊藻的各指标进行测定，包括生长抑制率、叶绿素a、藻胆蛋白及总可溶性蛋白含量。【结果】水杨酸浓度越高，对铜绿微囊藻的抑制作用越明显，以0.12 g/L水杨酸的抑制率最高，且抑制作用随时间的延长而不断增强，48 h后抑制率达95.66%。经0.10 g/L水杨酸处理后，铜绿微囊藻的叶绿素a、藻胆蛋白及总可溶性蛋白含量基本维持在初始水平；0.12 g/L水杨酸能有效抑制铜绿微囊藻的叶绿素a含量，促使铜绿微囊藻中的藻蓝蛋白（PC）含量相对降低、别藻蓝蛋白（APC）含量相对上升，但藻红蛋白（PE）含量基本维持在初始水平。【结论】水杨酸通过抑制铜绿微囊藻的叶绿素a等光合色素，阻遏其对光的捕获及吸收，扰乱藻胆蛋白各组分构成，从而致使藻类生长受抑，甚至死亡。即藻类叶绿素a是水杨酸抑制铜绿微囊藻生长的一个作用位點。

关键词： 铜绿微囊藻；水杨酸；化感抑制；叶绿素a；藻胆蛋白

中图分类号： S968.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0169-05

Abstract：【Objective】The present study explored the effects of exogenous salicylic acid on growth and photosynthetic system of Microcystis aeruginosa， in order to provide basis for application of salicylic acid in algaecide research and development. 【Method】Through artificial culture， M. aeruginosa was treated with salicylic acid at different concentrations （0.02， 0.04， 0.06， 0.08， 0.10 and 0.12 g/L）. After that， growth inhibition rate， chlorophyll a， phycobiliproteins and total soluble protein content in M. aeruginosa were detected by spectrophotometer and various reagents and kits. 【Result】The higher the concentration of salicylic acid Nas， the more obvious the inhibitory effect on M. aeruginosa. When the concentration of salicylic acid was 0.12 g/L， the inhibitory effect was the strongest， and the inhibitory effect enhanced as time extended. The inhibition rate reached 95.66% after 48 hours. After treated with 0.10 g/L salicylic acid， chlorophyll a， phycobiliprotein and total soluble protein of M. aeruginosa maintained at initial level. While 0.12 g/L salicylic acid could effectively inhibit chlorophyll a. The content of phycocyanin（PC） was decreased and content of allophycocyanin（APC） was relatively increased， but content of phycoerythrin（PE） basically maintained at initial level. 【Conclusion】Salicylic acid inhibits the capture and absorption of light， and disturb component composition of phycobiliproteins by disturbing the composition of phycobiliprotein by inhibiting photosynthetic pigments of M. aeruginosa such as chlorophyll a， which results in inhibition of algae growth and even death. Therefore algae chlorophyⅡa is an action site for salicylic acid inhibiting growth of M. aeruginosa.

Key words： Microcystis aeruginosa； salicylic acid； allelopathy inhibition； chlorophyll a； phycobiliprotein

0 引言

【研究意义】蓝藻水华的暴发不仅严重影响水域生物多样性，阻遏水产养殖业的发展，给水产养殖经济带来巨大损失，其代谢产物微囊藻毒素还能直接或间接威胁人类健康（Codd et al.，2005；Smith et al.，2008）；而化感物质的发现及其研究为控制蓝藻水华提供较好的方向和思路（孙文浩和余叔文，1992；Nakai et al.，2000，2005；Wu et al.，2007）。化感物质主要是植物（包括微生物）产生的次生代谢产物，其分子量小、结构简单，在自然生态系统条件下通常易降解，不易积累，生态安全性较好。因此，利用化感作用抑制水华藻类是当前水产生态学研究的热点和重点。【前人研究进展】迄今所发现的化感物质几乎都是植物次生代谢物，其中酚酸类化感物质是自然水体中水生植物分泌的一类重要次生代谢产物，对多种水华藻类具有较强的化感活性（丁惠君等，2007；倪利晓等，2011）。Planas等（1981）在穗花狐尾藻萃取物中发现有12种酚和多酚物质（如没食子酸、鞣花酸）能抑制藻类生长；Gross等（1996）从狐尾藻中萃取获得具有抑藻活性的多酚物质（没食子酸和鞣花酸）；喻景权和松井佳久（1999）从豌豆和黄瓜根分泌物中分别鉴定出苯甲酸、对羟基苯甲酸等多种具有抑制作用的酚酸类物质；Nakai等（2000，2005）在研究穗花狐尾藻对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的抑制作用时，发现穗花狐尾藻分泌物中含有焦酸、没食子酸等酚酸类化感物质。水杨酸（Salicylic acid，SA）是酚酸中的重要代表，是一种由植物体内产生的简单酚酸类化合物，广泛存在于高等植物中，是抑菌剂和除藻剂的主要成分之一（齐秀东，2007）。郑国兴等（2006）以水杨酸为效应物研究其酶学效应和微生物效应，结果表明，水杨酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种细菌和白色假丝酵母、黑曲霉2种真菌均有明显的抑制作用。吴安平等（2008）发现一定浓度的水杨酸能有效抑制水华鱼腥藻的生长，其最佳抑藻浓度为0.6 mmol/L。闫浩等（2014）研究发现，水杨酸作用初期铜绿微囊藻胞外多糖和微囊藻毒素含量增加以应对水杨酸造成的胁迫，但后期胞内、外微囊藻毒素含量均有所下降。【本研究切入点】目前，尚无有关水杨酸对铜绿微囊藻藻胆蛋白及光合系统影响的研究报道。【拟解决的关键问题】以铜绿微囊藻为研究对象，探讨外源水杨酸对铜绿微囊藻生长及光合系统的影响，以期为将水杨酸应用于除藻剂研发提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

铜绿微囊藻藻种购自中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库，编号为FACHB-434。铜绿微囊藻培养按淡水藻种库提供的配方，采用BG11培养基培养。培养条件：温度（25±0.5）℃，光照强度3000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天摇动3～5次。水杨酸（分析纯）购自上海国药集团化学试剂有限公司。主要仪器设备：智能型光照培养箱（MGC-250BPY-2型）、分光光度计（DU730）及低速冷冻离心机（Allegra X-15R）等。

1. 2 水杨酸对铜绿微囊藻的抑制作用

将水杨酸加入到处于指数生长期的铜绿微囊藻中，藻液初始OD为0.109，总藻液体积150 mL，锥形瓶中水杨酸最终浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12 g/L；对照组用BG11培养基代替水杨酸溶液，每组设3个平行，每天同一个时间点测定铜绿微囊藻OD680 nm，其生长以OD变化量表示。

水杨酸对铜绿微囊藻生长抑制率（IR）的计算公式：

IR（%）=（1-N/N0）×100

式中，N为加入水杨酸组藻的OD680 nm，N0为对照组藻初始OD680 nm。

1. 3 生理生化指标测定

1. 3. 1 叶绿素a含量测定 参考李慧敏等（2007）的方法，即取3.0 mL培养液，3500 r/min离心10 min，弃上清液，然后加入等体积90%甲醇（v/v），混合均匀。将混匀的溶液置于4 ℃黑暗条件下萃取6～8 h，然后3500 r/min离心10 min，取上清液，采用分光光度计测定其在665 nm处的吸光值，计算叶绿素a含量（c，μg/mL）。计算公式：c=13.9OD665 nm。

1. 3. 2 藻胆蛋白含量测定 参考吴忠兴（2006）的方法，即取铜绿微囊藻液3.0 mL，10000 r/min离心5 min，弃上清液后加入3.0 mL PBS（0.05 mol/L，pH 6.8），置于-80 ℃超低温冰柜中冷冻8 h，室温暗处自然溶解，如此反复冻融3～4次，10000 r/min离心5 min，取上清液，用酶标仪测定其在620、650和565 nm处的吸光值。根据下列公式分别计算藻胆蛋白各组分含量：

PC（mg/mL）=（OD620 nm-0.70OD650 nm）/7.38

AP（mg/mL）=（OD650 nm-0.19OD620 nm）/5.65

PE（mg/mL）=（OD565 nm-2.80PC-1.34AP）/1.27

1. 3. 3 总可溶性蛋白含量测定 取受试铜绿微囊藻3.0 mL置于10 mL离心管中，4000 r/min离心10 min，弃上清液，得到浓缩藻细胞。加入3.0 mL PBS（0.05 mol/L，pH 6.8）于浓缩藻细胞中，混合均匀，4000 r/min离心10 min，取0.05 mL上清液，采用南京建成生物工程有限公司试剂盒测定总可溶性蛋白质量浓度（g/L）。

1. 4 统计分析

所有试验数据用Excel 2003和SPSS 19.0进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 水杨酸对铜绿微囊藻生物量的影响

2. 1. 1 水杨酸对铜绿微囊藻OD的影响 试验观察到，24 h后对照组铜绿微囊藻水体颜色较绿，而高浓度水杨酸处理组（0.10和0.12 g/L）的水体颜色开始由绿变黄，藻体蓄积、沉淀现象相较对照组明显。由图1可知，对照组铜绿微囊藻OD一直呈上升趋势，0.02、0.04、0.06和0.08 g/L 4个水杨酸处理组的铜绿微囊藻OD也随时间延长呈逐渐上升趋势，但随水杨酸浓度的增加，与同期对照组铜绿微囊藻OD的差距越明显。0.12 g/L处理组的铜绿微囊藻OD下降趋势最明显，至48 h时已基本检测不到铜绿微囊藻OD；而0.10 g/L处理组的铜绿微囊藻OD基本维持在初始水平，变化不明显。

2. 1. 2 水杨酸对铜绿微囊藻抑制率的影响 由图2可知，0.02 g/L水杨酸处理组在4 h时不仅没有抑制藻生长，反而呈略微的促生长作用，但随着时间的延长促进作用逐渐转为抑制作用。0.04、0.06和0.08 g/L 3个水杨酸处理组均表现出抑制作用，但各处理组间差异不明显。从图2还可看出，水杨酸浓度越高，对铜绿微囊藻抑制作用越明显。其中，0.12 g/L水杨酸处理组对铜绿微囊藻的抑制率最高，且抑制作用随时间延长而不断增强，24 h后水杨酸对铜绿微囊藻的抑制率达80.82%，至48 h时抑制率达95.66%。化感物质对藻类化感作用的强弱与其浓度密切相关。已有研究表明，化感物质对藻类的化感作用存在低促高抑现象（吴安平等，2008）。本研究中，水杨酸对铜绿微囊藻主要表现为抑制作用，且浓度越高抑制效果越强。

2. 2 水杨酸对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

由表1可看出，0.02、0.04、0.06和0.08 g/L 4个水杨酸处理组和对照组的铜绿微囊藻叶绿素a含量均随时间推移而逐渐增加，至24 h時0.02、0.04和0.06 g/L 3个水杨酸处理组的铜绿微囊藻叶绿素a含量差异不显著（P>0.05，下同），但0.02与0.08 g/L水杨酸处理组间差异显著（P<

0.05，下同）。0.12 g/L水杨酸处理组的铜绿微囊藻叶绿素a含量在12 h时较低，与对照组间存在显著差异，至96 h时已基本检测不到；而0.10 g/L水杨酸处理组的铜绿微囊藻叶绿素a含量随时间推移的变化较小，基本维持在初始水平。

2. 3 水杨酸对铜绿微囊藻藻胆蛋白含量的影响

铜绿微囊藻的藻胆蛋白包括藻蓝蛋白（PC）、别藻蓝蛋白（APC）和藻红蛋白（PE），能将吸收的能量传递给藻细胞叶绿素a，即光合系统Ⅱ（PSⅡ），且这3种藻胆蛋白是蓝藻光合作用捕光天线的主要功能团。由图3可知，0.02、0.04、0.06和0.08 g/L 4个水杨酸处理组的PC含量变化趋势基本上与对照组一致，均在96 h时急剧上升；0.10 g/L水杨酸处理组的PC含量保持在初始水平；0.12 g/L水杨酸处理组的PC含量急剧下降，至96 h时基本检测不到。由图4可知，各水杨酸处理组间的APC含量变化较平缓，且随时间推移的变化不明显。由图5可知，各水杨酸处理组间的PE含量在48 h内基本维持不变，至96 h时各水杨酸处理组间的PE含量呈不同程度的上升趋势，组间差异不明显，但以0.12 g/L水杨酸处理组的PE含量增幅最低，基本维持在初始水平。

2. 4 水杨酸对铜绿微囊藻总可溶性蛋白含量的影响

由表2可看出，加入不同剂量水杨酸后铜绿微囊藻细胞内的总可溶性蛋白含量均呈下降趋势。其中，经0.02、0.04、0.06和0.08 g/L水杨酸处理48 h的铜绿微囊藻细胞内总可溶性蛋白含量分别为对照组的97.2%、94.4%、91.7%和88.9%；经0.10 g/L水杨酸处理48 h时的铜绿微囊藻细胞内总可溶性蛋白含量为对照组的75.0%，96 h后为对照组的60.0%；而0.12 g/L水杨酸处理24 h的铜绿微囊藻细胞内总可溶性蛋白含量为对照组的66.7%，96 h后仅为对照组的2.2%。可见，经高浓度水杨酸处理后，铜绿微囊藻细胞内总可溶性蛋白含量明显下降，进而影响藻细胞组织构成，阻遏其正常的生长代谢，最终致使铜绿微囊藻细胞死亡。

3 讨论

利用化感物质进行抑藻是研究蓝藻水华防治途径的一个热点（吴安平等，2008）。酚酸类是一类重要的化感物质，可快速抑制藻类生长，且能在自然条件下降解，生态安全性好，操作方便（Vyvyan，2002）。其中，水杨酸广泛存在于高等植物中，是一种方便易获得的小分子酚酸类化感物质。本研究结果表明，水杨酸能有效抑制铜绿微囊藻生长，且浓度越高抑制效果越佳。吴安平等（2008）研究水杨酸对水华鱼腥藻的化感抑制作用时，发现水杨酸对鱼腥藻存在低促高抑现象，最佳抑制浓度为0.6 mmol/L，与本研究结果有所不同，可能是水杨酸的作用对象及使用剂量不同，从而引起不同的作用效果。

化感物质可通过多种不同的途径影响植物正常生长代谢，其中最常见的途径是通过抑制PSⅡ活性来影响植物的光合作用，从而抑制植物生长（Weir et al.，2004）。Czarnota等（2001）研究表明，高粱根浸出液中的酚类物质能通过与高等植物的QB位点结合，从而对高等植物的PSⅡ活性呈显著抑制作用。Gog等（2005）研究表明，粗柠檬精油中的A2蒎烯和柠檬烯也能显著抑制PSⅡ活性。本研究结果表明，水杨酸能抑制铜绿微囊藻叶绿素a合成，尤其在高浓度下对铜绿微囊藻叶绿素a的降解作用更明显，从而降低铜绿微囊藻对光能的吸收、转化，加速藻细胞死亡；经高浓度（0.12 g/L）水杨酸处理铜绿微囊藻中的PC含量相对降低、APC含量相对上升，而PE含量基本维持在初始水平。因此推测，水杨酸能抑制铜绿微囊藻的叶绿素a等光合色素，阻遏铜绿微囊藻细胞对光的捕获及吸收，降低藻细胞内光反应效率，抑制有机物、ATP等合成，从而扰乱铜绿微囊藻中藻胆蛋白各组分构成，致使藻类生长受抑，甚至死亡。

4 结论

水杨酸通过抑制铜绿微囊藻的叶绿素a等光合色素，阻遏其对光的捕获及吸收，扰乱藻胆蛋白各组分构成，从而致使藻类生长受抑，甚至死亡。即藻类叶绿素a是水杨酸抑制铜绿微囊藻生长的一个作用位点。

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（責任编辑 兰宗宝）