曾莉莎 庄华才 胡规媛 吕顺 莫秀文 杜彩娴 梁少丽 郑芝波 周建坤 王芳
摘要:【目的】筛选对荷花腐败病菌有较强拮抗作用的生防菌,为荷花的健康生产及荷花腐败病的有效控制提供参考。【方法】采用抑菌圈法和对峙培养法从106株供试拮抗细菌中筛选对荷花腐败病菌有较强拮抗作用的生防菌,经形态学、生理生化和分子鉴定确定生防菌分类地位,通过与其他6种作物病原真菌的对峙培养了解生防菌的抑菌谱,并通过田间小区试验明确生防菌的田间防治效果。【结果】从供试的106株测试菌株中筛选获得4株对荷花腐败病菌具有拮抗效果的生防菌,其中以DR1菌株的拮抗效果最佳,抑菌带宽为9.8 mm。DR1菌株的拮抗谱较宽,对供试6种植物病原真菌均具有良好的抑制活性。田间防效试验结果表明, DR1菌株对荷花腐败病的平均防效为41.83%。根据16S rDNA和gyrB基因序列分析结果并其结合生理生化特征,将DR1菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。【结论】解淀粉芽孢杆菌的拮抗活性、耐热性和抗逆性强,且有较宽的抗菌谱,在荷花病害防治中具有较好的开发应用前景。
关键词: 荷花腐败病;生物防治;解淀粉芽孢杆菌;鉴定
中图分类号: S476 文献标志码:A 文章编号:2095-1191(2017)01-0092-08
Abstract:【Objective】The present study screened and identified the biocontrol bacteria against Fusarium commune, in order to provide reference for healthy planting of lotus and effective control of lotus rhizome rot disease. 【Method】Inhibition zone method and confrontation culture were employed to screen the biocontrol bacteria which had strong antagonism against F. commune out of 106 tested antagonistic bacteria. The biocontrol bacteria were identified according to morphology, physiology, biochemistry and molecular identification. Through confrontation culture with six phytopathogenic fungi, antimicrobial spectrum of the biocontrol bacteria was studied. Field control effects of biocontrol bacterium were explored through field experiment. 【Result】Four biocontrol bacteria with antagonism against lotus rhizome rot disease were selected out of 106 tested strains. Antagonist effects of strain DR1 was the best. Its bacteriostasis band width was 9.8 mm. Strain DR1 enjoyed wide antimicrobial spectrum, and showed inhibitory effects towards six tested phytopathogenic fungi. The field experiment results showed that average control effect of strain DR1 was 41.83%. Strain DR1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens for its biochemical characteristics based on 16S rDNA and gyrB gene sequence analysis. 【Conclusion】B. amyloliquefaciens has strong antagonism effect, heat resistance, strong stress resistance, and broad antimicrobial spectrum. Therefore, it possesses promising developing and applying prospect in lotus disease control.
Key words: lotus rhizome rot disease; biological control; Bacillus amyloliquefaciens; identification
0 引言
【研究意義】荷花是我国十大名花中唯一的水生花卉,在我国的湿地及观光农业旅游等区域广泛栽培。荷花全身都是宝,莲子、莲藕、莲心、荷叶等均可食用或药用,是人们喜爱的美食和养身佳品。荷花在生长发育过程中常受到荷花腐败病(藕瘟)、小菌核叶腐病、叶疫病、褐斑病、叶片炭疽病和花叶病等10余种病害的危害(张宝棣等,1996;陈金安等,2006;何晓婵等,2013;匡晶等,2015),其中腐败病是荷花种植区发生最普遍且为害严重的病害之一(胡长志等,2013),在荷花生长期和莲藕贮藏期均可发病,全国各荷花产区均有发生。荷花腐败病属土传病害,病菌常造成藕鞭、藕节、藕根腐烂,同时地上部分的叶、花也会萎蔫黄枯,发病严重的整株枯死(梁志怀等,2010)。荷花腐败病发生普遍,危害巨大,已成为制约荷花产业发展的重大障碍,也是我国发展都市农业过程中面临的重要瓶颈问题。在荷花腐败病防治中,由于荷花叶片的特殊结构(叶上表层有蜡质),一般农药喷施不易被吸收,加之荷花是水生植物,施药难度较大,导致化学防控对荷花腐败病效果甚微。生物防治以其环境友好、安全等特性成为当前植物病害防治研究的热点。因此,筛选对荷花腐败病具有较好防治效果的生防菌,对荷花产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来,国内很多学者对莲(荷花)腐败病的病原菌、发生规律和化学防治进行了研究,并筛选出多种化学药剂。陈传聪等(2008)选用凯润等杀菌剂对莲腐败病进行田间防效试验,结果表明,25%凯润乳油、30%爱苗乳油、25%丙环唑乳油和50%苯菌灵可湿性粉剂对莲腐败病均有较好的防治效果。梁志怀等(2010)对湖南省不同地区莲腐败病菌的致病性及遗传差异性进行研究,结果表明,不同莲腐败病镰孢菌间致病力存在一定差异。曾璐(2013)研究了化学药剂和4种生防菌剂对莲腐败病的防病效果,结果表明,生防菌X23对湘莲有明显的增产作用,但由于后续田间调查未发现湘莲腐败病为害,因此未进行发病率及病情指数记录。周小军等(2015)对莲藕腐败病菌的生物学特性进行研究,结果表明,莲藕腐败病菌对温度、pH、光照等适应范围广,最适温度为28 ℃,最佳pH为7。【本研究切入点】目前关于荷花腐败病生物防治及生防菌筛选的研究报道较少。【拟解决的关键问题】从土壤微生物中筛选能有效控制荷花腐败病的生防菌株,并利用生物学特性和分子生物学手段对生防菌进行鉴定,为开发荷花腐败病生防菌制剂提供菌种资源,也为荷花的健康生产及该病害的有效控制提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 供试致病菌株 荷花腐败病菌(Fusarium commune)Hhgw-2-4(曾莉莎等,2016)由东莞市香蕉蔬菜研究所从东莞桥头镇莲湖公园发病荷花地下茎分离获得,并经致病力测定确定为荷花腐败病病原菌。莲小菌核叶腐病菌(Sclerotium hydrophilum)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、甘蔗梢腐病菌(Fusarium sacchari)、火龙果溃疡病菌(Neoscytalidium dimidiatum)和辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)均由东莞市香蕉蔬菜研究所保存。
1. 1. 2 拮抗菌来源 2013~2015年,先后对采自广东省东莞市6个镇的46份不同作物根际土壤样品进行分离,其中香大蕉根际土壤样品16份、蔬菜根际土壤样品8份、甘蔗根际土壤样品8份、荷花根际土壤样品14份。从不同作物的根际土壤中共分离到拮抗细菌106株,其中分离自菜地15株、分离自甘蔗地35株、分离自香大蕉地32株、分离自荷塘土壤24株。所分离菌株保存于东莞市香蕉蔬菜研究所微生物实验室。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 生防菌筛选
1. 2. 1. 1 生防菌初筛 采用抑菌圈法筛选生防菌。将荷花腐败病菌Hhgw-2-4制成1×106 CFU/mL的孢子悬浮液,用移液器吸取30 μL均匀涂布在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上,在培养基四周(距离中心2.5 cm处)放置4个直径0.6 cm的圆滤纸片,吸取10 μL待测试生防菌菌悬液滴在滤纸上,以加入等量无菌水的PDA培养基为对照,每个测试菌株3次重复。28 ℃培养5 d后,测量不同测试菌株的抑菌圈大小,筛选出抑菌效果较好的生防菌。
1. 2. 1. 2 生防菌复筛 采用室内平板对峙法对初筛抑菌效果较好的生防菌进行复筛。从培养4 d的荷花腐败病菌菌落边缘取直径为6 mm的菌饼,将菌饼移至空白的PDA培养基中央,在其四边2.5 cm处等距离接入经初筛获得的细菌,设不接种拮抗菌的培养基为对照,每个测试菌株3次重复。28 ℃培养7 d后,观察不同测试菌株对荷花腐败病菌的抑制效果,计算平均抑菌带宽度,选取抑菌带最宽的拮抗细菌作为荷花腐败病生防菌。
1. 2. 2 形态学鉴定 对筛选获得的生防菌,采用平板划线法对其进行分离纯化,观察记录菌落形态;根据革兰氏染色结果确定该细菌的细胞壁类型(程丽娟等,2000;东秀珠和蔡妙英,2001)。
1. 2. 3 生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英,2001)对筛选获得的生防菌进行最适生长温度、pH、营养源、代谢特征等生理生化鉴定。
1. 2. 4 抑菌谱测定 选用平板对峙培养法进行抑菌谱测定(李建嫄等,2013)。将供试靶标致病菌菌饼(d=6 mm)置于PDA培养基中央,在其四周等距离(2.5 cm)处接入筛选获得的生防细菌,以不接任何細菌的培养基为对照,每处理3次重复。28 ℃恒温培养7 d后,观察生防菌对莲小菌核叶腐病菌、番茄灰霉病菌等不同植物致病菌的抑制情况,测量并计算平均抑菌带宽度,用SPSS 19.0进行数据统计分析。
1. 2. 5 分子鉴定 利用16S rDNA和DNA解旋酶B亚基编码基因(gyrB)对筛选获得的菌株进行鉴定,16S rDNA序列和gyrB基因扩增引物和方法参照喻国辉等(2010)的描述。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离得到目的条带。目的片段经DNA胶回收试剂盒回收纯化后克隆到pMD18-T载体(TaKaRa)上,阳性克隆由赛默飞生命科学有限公司(Thermo Fisher)测序。获得的基因序列在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上应用BLASTn软件进行DNA序列相似性分析,从GenBank数据库中下载相近模式菌株的gyrB和16S rDNA序列,利用MEGA 5.0软件Neighbour-joining法构建系统发育进化树。
1. 2. 6 田间防效试验 选用1块荷花腐败病重病田作为试验区(连续3年荷花腐败病发病率在50.00%以上),试验点位于广东省东莞市桥头镇。种藕移栽前先用筛选获得的生防菌1000倍发酵液浸泡试验区土壤3 d,覆水深度2 cm,同时用稀释500倍的生防菌发酵液对种藕进行浸泡处理,浸泡12 h后捞出播种。播种后从荷花出现浮叶开始施用生防菌,以后根据天气情况每隔10~15 d用稀释800倍的生防菌液喷施叶面1次,共施用3次,以不使用任何药剂的处理为空白对照,每处理3次重复,每重复小区面积约0.07 ha,不同小区间用田埂隔开(如图5-A所示)。在对照处理荷花出现萎蔫后开始调查,每隔10 d调查1次病叶率,至荷花腐败病病情不再发展为止,共调查4次。按发病率和防效计算田间试验结果。
发病率(%)=(病叶数/调查的总叶片数)×100
防效(%)=(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100
1. 3 统计分析
试验数据利用SPSS 19.0进行统计分析。
2 结果与分析
2. 1 生防菌的筛选
采用抑菌圈法从106株供试拮抗细菌中初步筛选出4株对荷花腐败病菌具有明显拮抗作用的菌株,进一步复筛,得到分离自甘蔗根际土壤的菌株DR1的拮抗作用最强,对荷花腐败病菌的抑菌带为9.8 mm(图1-A)。选取DR1菌株进行后续试验。
2. 2 拮抗细菌DR1的抑菌谱测定
对峙培养结果表明,拮抗细菌DR1对供试莲小菌核叶腐病菌、香蕉枯萎病菌、番茄灰霉病菌、甘蔗梢腐病菌、火龙果溃疡病菌和辣椒疫病菌均表现出较强的抑制作用(图1),其中,对莲小菌核叶腐病菌的抑制作用最强,其抑菌带宽与其他植物病原菌抑菌带宽差异显著(P<0.05,下同),其次为火龙果溃疡病菌和香蕉枯萎病菌(表1),表明DR1菌株是一株广谱拮抗细菌。
2. 3 生防菌株DR1的种类鉴定
2. 3. 1 菌落形态 DR1菌株在LB培养基上培养24 h后形成的单菌落类似圆形,边缘不规则,有隆起,表面褶皱,不透明,干燥,菌落呈浅黄色;液体培养静止时有菌膜形成。显微镜下观察,菌体杆状,周生鞭毛,形成芽孢,芽孢卵圆形,卵囊膨大(图2)。
2. 3. 2 生理生化特性 DR1菌株的生理生化特性表现:革兰氏染色呈阳性,菌株接触酶、厌氧生长、硝酸盐还原、酪朊水解、明胶水解、淀粉水解、柠檬酸盐利用和V-P反应呈阳性,酪氨酸水解和苯丙氨酸脱氨酶为阴性,可利用D-葡萄糖、甘露醇、L-阿拉伯糖及D-木糖作为碳源(表2)。观察发现,DR1菌株在pH 5.7条件下能生长;在5% NaCI下不生长;在50 ℃下不生长(表2)。參照东秀珠和蔡妙英(2001)的方法,初步判断DR1菌株为芽孢杆菌或类芽孢杆菌属。
2. 3. 3 分子生物学鉴定结果
2. 3. 3. 1 16S rDNA序列分析 测序结果表明,扩增的16S rDNA序列全长1417 bp,将3个阳性克隆送至Thermo Fisher公司测序,获得的序列在NCBI上经BLASTn软件同源序列检索发现,在亲缘关系相近的前100个序列中,有解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌2种。以16S rDNA同源性为基础,选取19个模式菌株的16S rDNA序列与DR1菌株构建系统发育进化树,结果(图3)表明,DR1菌株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)同处于一个最小的分支,与已知模式菌株Bacillus amyloliquefaciens NRRL BD-601(Rooney et al.,2009)的同源性达100%。
2. 3. 3. 2 gyrB基因序列分析 扩增的gyrB基因序列长度为1230 bp,基于gyrB基因序列构建的系统发育进化分析显示,DR1菌株与解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefaciens)菌株JQ658430和DQ309294等聚在同一个分支上,与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilies)明显区分(图4)。因此,将DR1菌株进一步鉴定为解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefaciens)。
2. 4 DR1菌株的田间防效
生防菌DR1处理后不同调查时期荷花腐败病的发病率及田间防效如表3所示。由表3可知,DR1菌株对荷花腐败病有一定的防效,不同调查时期相对防效为29.85%~57.26%,平均防效为41.83%(图5)。不同调查时期生防菌DR1对荷花腐败病的防效差异显著,越到发病后期,DR1菌株的防治效果越好。
3 讨论
荷花腐败病是由镰孢菌(Fusarium commune)引起的重要土传病害,是荷花产业持续发展的一个重要障碍(葛有茂和赵士熙,2009;胡长志等,2013)。生物防治因无毒、高效、成本低等优点成为病虫害防治的研究热点。本研究从106株分离自土壤的细菌中筛选出1株对荷花腐败病菌及其他6种植物病原真菌具有明显抑制作用的菌株DR1,经生理生化鉴定、16S rDNA和gyrB基因分析,DR1菌株属于解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)。
芽孢杆菌繁殖能力强、营养简单,且能产生耐热抗逆的芽孢,有利于其生防菌剂的批量生产及大田推广应用(陈志谊等,2010;向亚萍等,2016)。许多田间应用研究表明,芽孢杆菌类生防菌剂在稳定性、持效性及与化学农药相容性等方面均明显优于非芽孢杆菌类生防菌,芽孢杆菌是在作物病害防治中值得大力开发及大面积推广利用的生物资源(陈志谊等,2010;洪鹏等,2013)。目前,已报道用于生物防治的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(B. subtilies)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)、多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)、地衣芽胞杆菌(B. licheniformis)和蜡状芽孢杆菌(B. cereus)等(郝华昆等,2007;吕捷等,2014;冯世鑫等,2015;伍善东等,2015)。解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)与枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的亲缘关系非常近,在其生长过程中可以产生抗真菌蛋白、伊枯草菌素、几丁质酶等代谢产物,这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆菌具有广泛的抗菌活性(Sun et al.,2006;Arrebola et al.,2010;张雪花等,2015)。
荷花真菌性病害是影响荷花生长发育的重要因素。目前荷花上常见的真菌病害有腐败病(藕瘟)、小菌核叶腐病、叶疫病、褐斑病和炭疽病等(张宝棣等,1996;匡晶等,2015)。由于各种病原菌的生物学特性差异明显,一种成功的荷花病害生防菌制剂要求所用的生防菌具备较宽的拮抗谱。本研究中筛选到的解淀粉芽孢杆菌DR1能显著抑制荷花腐败病菌生长,且对莲(荷花)小菌核叶腐病、香蕉枯萎病菌、番茄灰霉病菌和火龙果溃疡病菌等也有较好的拮抗作用,说明这株拮抗菌除对荷花腐败病菌有抑制效果外,也可用于其他病害的防治,应用前景较好。
本研究田间试验结果显示,DR1菌株对荷花腐败病具有较好的防效,不同发病时期的平均相对防效为41.83%,特别是越到发病后期,DR1菌株的防治效果越好,说明该生防菌的田间防效稳定性及持效性较好。总之,DR1菌株具备较宽的抗菌谱,可产生芽孢,耐热及抗逆性强,在荷花病害防治中不失为一株有较好开发应用前景的生防菌。但DR1菌株能否在生产上推广应用,还需对其在土壤及植株上的定殖能力、防效稳定性和生态效应等进行深入研究,并要进一步开展多年多点试验,以明确其应用潜力。
4 结论
本研究从田间分离到1株对包括荷花腐败病菌在内的多种植物病原菌均表现良好拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens),该菌株的拮抗活性、耐热性和抗逆性强,且有较宽的抗菌谱,在荷花病害防治中具有较好的开发应用前景。
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(责任编辑 麻小燕)