不同抗褐变剂组合对海南龙血树组织培养及抗褐变效果的影响

胡燕梅　方中明　郑孝丹

摘要：[目的]探讨不同抗褐变剂及其组合对海南龙血树组织培养及抗褐变效果的影响，为其种苗的快速繁殖提供参考依据。[方法]采用3种抗褐变剂处理海南龙血树外植体嫩茎，开展愈伤组织诱导与抗褐变试验；在基本培养基MS中添加不同浓度的6-BA～和NAA组合，检测其对海南龙血树愈伤组织分化不定芽和丛生芽形成的影响。[结果]海南龙血树嫩茎在0.1g/L半胱氨酸（Cys）溶液中浸泡10mind接种于含0.1g/L维生素c（Vc）的培养基中，褐变率比对照（cK）低，仅20.5%，愈伤组织诱导率最高，为75.5%；适宜龙血树嫩茎愈伤组织诱导的植物生长调节剂组合为6.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，诱导率为75.5%；适宜龙血树芽增殖的植物生长调节剂组合为r4.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，增殖倍数为3.3。[结论]采用Cys和Vc两种抗褐变剂组合处理可适当减轻龙血树组培过程中嫩茎的褐变程度，促进愈伤组织诱导；培养基中适当添加6-BA和NAA可促进愈伤组织的不定芽分化和丛生芽形成。

关键词：海南龙血树；愈伤组织；褐变；半胱氨酸（cys）；维生素c（vc）

中图分类号：S722.37 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2023-07

0引言

[研究意义]海南龙血树（DracaenacambodianaPierreexGagnep.）为龙舌兰科常绿灌木，生长十分缓慢，生命期长达八千年，被誉为植物寿星，是我国传统名贵中药材血竭的两种基源植物之一，主要分布于热带雨林，多用于园林观赏。由于某些生态因子严重抑制种子萌发或小苗生长，海南龙血树自然更新极差（郑道君等，2009，2016），我国已将其定为珍稀濒危植物，属国家二级重点保护树种。目前海南龙血树野生资源因遭受掠夺性采挖而急剧下降。随着市场需求的增加，应加快开展龙血树野生资源繁育技术研究，并建立规范化、规模化的生产基地以满足市场需求（黄莉雅等，2009）。规模化种植基地的培育首先需要规模化种苗的生产，而海南龙血树较难收获种子，繁殖率较低，通过植物组织培养繁育种苗又存在愈伤组织褐化严重等问题。因此，探讨海南龙血树的组织培养及其抗褐变措施，对龙血树种苗的快速繁育和资源的保护利用具有重要意义。[前人研究进展]杨晓虹等（2009）研究了剑叶龙血树愈伤组织的形成，结果出现严重褐化；黄莉雅等（2010）以剑叶龙血树芽为外植体诱导芽分化，同时探讨了聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性碳（AC）防褐化的效果；靳静晨等（2010）研究发现，海南龙血树可以顶芽或腋芽为外植体诱导丛生芽形成，但这种外植体取材方式会消耗大量母本材料；罗冠勇等（2012）以海南龙血树侧芽和顶芽为外植体诱导愈伤组织时，发现暗培养可减轻褐变，提高诱导率；齐安民等（2015）提出控制普通也门铁茎段褐化效果最理想的培养基为MS+0.25g/LVc+0.50g/LNa₂S₂O₃；吳雪松等（2017）以海南龙血树顶芽和茎段为外植体在含6-BA和NAA的培养基中可获得愈伤组织和不定芽。[本研究切入点]海南龙血树为木本植物，其外植体茎段前期培养形成愈伤组织过程中褐化现象严重，影响愈伤组织的形成和再分化，难以快速繁殖，而目前针对抗褐变现象开展的试管苗快速生产研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]探讨海南龙血树愈伤组织初始培养阶段的抗褐变措施及后期试管苗增殖的适宜激素组合，为海南龙血树种苗工业化生产提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

海南龙血树购于武汉堤角花卉市场。常规消毒流程为：取健康植株长约5.0cm幼嫩茎段，置于洗洁精中泡3-5min后用自来水冲洗30min，再用蒸馏水冲洗5次；将幼嫩茎段置于超净工作台上用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗1次，再用0.1%HgCl₂溶液泡8min，无菌水反复冲洗4次。将消毒后的茎段切成长约1.0cm的小段，每个茎段尽量带一个腋芽，接种于各试验组培养基中。接种材料均置于光照培养室中培养，培养温度（25±2）℃，光照强度1500lX，光照时间10h/d。

1.2试验方法

1.2.1外植体茎段愈伤组织诱导与抗褐变试验 以MS+30.0g/L蔗糖+5.6g/L琼脂+6.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA（pH=5.8±0.2）为基本培养基，以海南龙血树嫩茎为外植体，经过常规消毒流程后直接接种于基本培养基中为对照（CK）；选择半胱氨酸（Cys）、维生素c（vc）和AC3种抗褐变剂，设Ⅰa-Ⅰe、Ⅱa-Ⅱi、Ⅲa-Ⅲg和Ⅳa-Ⅳb共23个处理（表1）。

1.2.26-BA和NAA组合对茎段愈伤组织诱导的影响 以MS+30.0g/L蔗糖+5.6g/L琼脂+0.1mg/LVc（pH=5.8+0.2）为诱导培养基，分别添加6.0、4.0和2.0mg/L3个水平的6-BA及0.5和1.0mg/L2个水平的NAA，切好的海南龙血树茎段均在0.1g/LCys溶液中浸泡10min后接种于诱导培养基上，以检测6-BA和NAA组合对茎段愈伤组织的诱导效果。

1.2.36-BA与NAA组合对丛生芽增殖的影响

以MS+30.0g/L蔗糖+5.6g/L琼脂为增殖培养基，添加6.0、4.0和2.0mg/L3个水平的6-BA及0.2和0.5mg/L2个水平的NAA，将1.2.2中愈伤组织上得到的海南龙血树芽切成有4-6个芽的丛生芽小块，转接到增殖培养基上，以检测6BA和NAA组合对丛生芽增殖的影响。

1.3测定项目及方法

1.2.1和1.2.2中各处理均培养45d后观察愈伤组织长势，以“-”表示无愈伤组织形成，“+”表示有愈伤组织形成，“+”越多表示愈伤组织长势越好。1.2.3中各处理的丛生芽生长状况记录同愈伤组织生长状况表示。统计有效接种数（接种培养45d后未污染的接种数），记录诱导率、褐变率、芽增殖倍数及长势状况。同时对材料的生长状态进行拍照。

愈伤组织诱导率（%）=（有效接种数中形成愈伤组织的茎段数/有效接种数）×100

褐变率（%）=（褐化的外植体茎段数/有效接种数）×100

丛生芽增殖率（%）=（增殖的丛生芽团数/接种的丛生芽团数）×100

不定芽分化率（%）=（再生不定芽的愈伤组织数/愈伤组织数）×100

丛生芽增殖倍数=增殖后芽总数/接种芽数

1.4统计分析

采用Excel2003对数据进行处理，以SPSS18.0进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1抗褐变处理对海南龙血树茎段愈伤组织诱导和褐变的影响

接种培养15d后部分嫩茎边缘处少量开始愈伤化，褐变得到有效控制，但大部分嫩茎褐变严重，且边缘处无愈伤化迹象（图1）；培养45d后已形成的愈伤组织多为绿色致密的桑葚状（图2）。

2.1.1单一抗褐变方式处理的抗褐变结果 由表2可知，CK的愈伤组织诱导率为0，褐变率达100.0%，完全无生长迹象；Ⅰa～Ⅰe5种抗褐变处理中，Ⅰa～Ⅰc处理的愈伤组织诱导率均为0，说明直接在培养基中加入抗褐变剂效果较差；Ⅰe处理的诱导率为50.4%，显著高于CK及其他单一抗褐变剂处理（P<0.05，下同），且褐变率仅35.5%，显著低于CK及其他大部分抗褐变处理（Ⅰb处理褐变率为0），说明海南龙血树嫩茎在Cys溶液中浸泡10min后再接种（Ⅰe处理），其愈伤组织诱导和抗褐变效果较好。

2.1.22种抗褐变方式组合处理的抗褐变结果

由表3可知，Ⅱa-Ⅱd处理的外植体经Cys或Vc浸泡后再接人含Vc或Cys的培养基中，其愈伤组织诱导率较CK均显著增加，褐变率显著降低，其中，Ⅱb处理的抗褐变效果最佳，其愈伤组织诱导率达75.5%，显著高于其他组合方式处理，褐变率也较低，仅20.5%，说明外植体在Cys溶液中浸泡10min后再接种到加有0.1g/LVc的培养基中，既可提高嫩茎的愈伤诱导率，又能降低褐变率；由表2和表3可知，Ⅱb与Ⅰe处理相比，其抗褐变效果也有所提高，褐变率下降15.0%（绝对值，下同），愈伤组织诱导率提高25.1%，说明外植体茎段经Cys浸泡后加入含Vc的培养基中，其愈伤组织诱导及抗褐变效果比单独浸泡Cys效果更佳；Ⅱe～Ⅱh处理的愈伤组织诱导率和褐变率均为0，而这些培养基中均有AC存在，说明抗褐变剂AC加入培养基中虽能控制褐变却不能诱导愈伤；Ⅱi处理中没有愈伤组织形成，褐变率也较高，印证了表1中Ⅰa+Ⅰb处理的抗褐变效果。

2.1.33种抗褐变方式组合处理的抗褐变结果

由表4可知，Ⅲa-Ⅲb处理的愈伤组织诱导率为0，且褐变严重；而Ⅲc-Ⅲg处理的褐变率虽为0，但诱导率也为0，即外植体既不能形成愈伤组织也未发生褐变，可能是由于Ⅲc-Ⅲg处理培养基中含有抗褐变剂AC所致，印证了表3中Ⅱe～Ⅱh处理的研究结果；在2.1.2中Ⅱb处理的抗褐变效果最佳，但Ⅲb处理的诱导率却为0，而Ⅲb处理比Ⅱb处理的培养基中仅多了抗褐变剂Cys，可能是Cys和Vc反应产生了某种物质，在试验中发现加有Vc和Cys的培养基均有难闻气味产生，导致诱导愈伤组织效果较差。

2.1.44种抗褐变方式组合处理的抗褐变结果由表5可知，Ⅳa和Ⅳb处理的褐变率均为0，其愈伤组织诱导率也为0，可能也是培养基中均加有抗褐变剂AC所致。

综合分析表2～表5结果可知，在培养基中加入AC处理的海南龙血树外植体的愈伤组织诱导率和褐变率均为0，即外植体茎段在加入AC的培养基中虽未褐变但也无任何生长迹象，说明AC在吸附有害物质的同时也吸附了培养基中的激素从而使其失去作用，影响了外植体的进一步生长发育。

综上所述，Ⅱb处理即外植体浸泡Cys后接种在加有Vc的培养基上，其抗褐变效果最佳，褐变率仅20.5%，愈伤组织的诱导率达75.5%，生长状况也较佳（图3），当愈伤组织长大到一定体积后产生了丛生芽（图4）。

2.26-BA和NAA组合对海南龙血树外植体愈伤组织诱导的影响

海南龙血树外植体茎段接种15d后观察，茎段边缘处开始发生愈伤迹象，30d时部分较大的愈伤组织表面出现绿色芽点，40d后绿色愈伤组织上均分化出小不定芽（图3）。培养45d后统计试验结果如表6所示，结果显示，最适宜龙血树嫩茎愈伤组织诱导的激素组合为6.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，诱导率为75.5%。

2.36-BA和NAA组合对丛生芽增殖的影响

丛生芽接种20d后芽丛表面开始出现新的芽点，新芽均为嫩绿色；培养45d后接种的丛芽基部侧边增殖了新芽，丛生芽增殖率均达100.0%，但芽增殖倍数存在差异，同时仍有少数芽丛基部发生了褐变（图4）。由表7可看出，各处理丛生芽增殖率均达100.0%，表明6-BA+NAA组合对海南龙血树丛生芽增殖效果明显，各处理虽然均有增殖，但增殖倍数差异显著。当6-BA浓度相同时，0.2mg/LNAA处理较0.5mg/LNAA处理更有利于丛生芽增殖；当NAA浓度一定时，随着6-BA浓度增加，其增殖倍数呈先增后降的变化趋势，其中4.0mg/L6-BA处理的丛生芽增殖倍数均最高，分别达3.3和1.2，说明添加0.2mg/LNAA比添加0.5mg/LNAA整体效果更好。

3讨论

外植体的木质化程度越高、切面与体积的比率越大，其褐化程度越严重；消毒剂对外植体的损伤程度越严重，褐化程度也越高（冯代弟等，2015），木本植物的外植体茎段在愈伤组织诱导阶段容易产生褐变。杨瑞玮（2012）报道硫代硫酸钠能有效控制林荫银莲花外植体褐变；谭谊谈和曾凯芳（2014）研究得出Cys和Vc处理可有效降低鲜切芋艿贮藏期间褐变度的结论。本研究选取3种抗褐变剂在两种不同方式下的23种处理对海南龙血树茎段初始培养阶段的抗褐变效果试验，取得了较理想的抗褐变效果。其中，以外植体茎段浸泡cvs溶液后接种于含有Vc的培养基中愈伤组织诱导和抗褐变效果较好，可能是嫩茎在Cys溶液中浸泡后对伤口有保护作用，而Vc又可以降低茎段伤口的氧化程度，所以能达到既降低褐变又提高愈伤化的目的。

6-BA是植物组织培养过程中常用的细胞分裂素之一。本研究在基本培养基中添力14.0mg/L6-BA后海南龙血树丛生芽增殖倍数最高，且增殖的芽长势最好，与何旭君等（2006）、陈梅和莫饶（2008）对海南龙血树的研究结果相似；但6-BA浓度高7：4.0mg/L后丛生芽增殖倍数下降。

试验过程中将海南龙血树愈伤组织上的丛生芽切割进行芽增殖时其丛生芽增殖效果较好，但直接将龙血树上的芽消毒后作为外植体进行接种時，其芽增殖效果却较差，芽下端仅愈伤化而未发生丛生芽。薛鹰等（2007）的试验结果也提出以海南龙血树的单芽为外植体诱导率降低，以单芽为外植体接种更易脱分化形成愈伤组织，但在继代增殖过程中，以丛芽为接种材料对芽的增殖数和生长均比单芽有利。本研究还发现，海南龙血树外植体茎段切割方式对试验的影响也很重要，由于海南龙血树是木本植物，其茎中央木质化严重，所以外植体切块时要除去中央木质化部分，且外植体上尽可能带一个腋芽，这样的带芽茎段作为外植体诱导愈伤组织的概率较高，外植体上腋芽抽生小芽的可能性也很高，与吴繁花等（2005）的研究结果相似。靳静晨等（2010）研究发现，海南龙血树以带腋芽的茎段为外植体也可直接进行丛生芽诱导，但目前此类研究报道较少。

李克烈等（2006）以海南龙血树种子为外植体进行愈伤诱导出芽的方式可快速繁殖海南龙血树植株，而本研究是以嫩茎为外植体诱导愈伤组织并获得丛生芽的方式，从而快速繁殖海南龙血树种苗，在外植体选取上有一定区别。

4结论

采用Cys和Vc两种抗褐变剂组合处理可适当减轻龙血树组培过程中嫩茎的褐变程度，促进愈伤组织诱导；培养基中添加适当浓度6-BA和NAA可促进愈伤组织上不定芽的分化和丛生芽的形成。

（责任编辑邓慧灵）