Yes相关蛋白在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达及与细胞增殖的相关性分析

邓慧仪 李美娇 王玮豪 黄雪琨 黄健聪 张革化 杨钦泰

【摘要】目的检测Yes相关蛋白（YAP）在慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）中的表达情况，初步探讨YAP在CRSwNP发病机制中的作用。方法收集对照组（13例）的下鼻甲黏膜和CRSwNP组（27例）的鼻息肉，采用实时荧光定量PCR的方法检测组织中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA的表达情况，并分析相关性。结果鼻息肉组织中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA的相对表达量均高于对照组，组间差异有统计学意义（P均<005）。YAP mRNA相对表达水平分别与TEAD1、TSLP、IL33、Ki67 mRNA相对表达水平呈正相关（rs=0568；rs=0693；rs=0745；rs=0561；P均<001）。结论YAP可能参与了CRSwNP的发病机制，并且可能与TSLP、IL33等上皮因子的表达增加从而介导鼻息肉细胞增殖有关。

【关键词】Yes相关蛋白；鼻息肉；上皮因子；细胞增殖；Ki67

Correlation analysis between expression levels of Yesassociated protein and cell proliferation in chronic rhinosinusitis with nasal polypsDeng Huiyi， Li Meijiao， Wang Weihao， Huang Xuekun， Huang Jiancong， Zhang Gehua， Yang Qintai Department of OtorhinolaryngologyHead and Neck Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University， Guangzhou 510630， China

Correspongding author，Yang Qintai， Email：yangqt@163com

【Abstract】ObjectiveTo measure the expression levels of Yesassociated protein （YAP） in chronic sinusitis with nasal polyps（CRSwNP） and preliminarily investigate the effect of YAP upon the pathogenesis of CRSwNP MethodsThe inferior turbinates mucosa was collected in the control group（n=13） and nasal polyp tissue was obtained in the CRSwNP group（n=27） Fluorescent quantitative RTPCR was performed to quantitatively measure the expression levels of YAP， TEAD1， TSLP， IL33 and Ki67 mRNA， and correlation analysis was conducted ResultsThe relative expression levels of YAP， TEAD1， TSLP， IL33 and Ki67 mRNA in the CRSwNP tissues were significantly higher compared with those in the control group（all P<005） The relative expression level of YAP mRNA was positively correlated with that of TEAD1 （rs=0568， P=0002）， TSLP （rs=0693， P<0001）， IL33 （rs=0745， P<0001） and Ki67 mRNA （rs=0561， P<0001） ConclusionsYAP is probably involved with the pathogenesis of CRSwNP It can mediate the cell proliferation of CRSwNP probably through upregulating the expression levels of TSLP， IL33 and other epithelial factors

【Key words】Yesassociated protein； Chronic sinusitis with nasal polyps； Epithelial factor；

Cell proliferation； Ki67

慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是耳鼻喉科最常见的疾病之一，变态反应和感染性炎症反应均为重要病因，但具体发病机制目前尚未完全阐明[1]。有研究发现标记细胞增殖的核蛋白Ki67抗原在鼻息肉组织中表达增加，提示鼻息肉组织中存在细胞过度增殖、组织重塑等表现，但鼻息肉细胞增殖如何被调控则未进一步探讨[23]。Yes 相关蛋白（YAP）是Hippo通路的关键蛋白，研究表明该通路可调控器官体积、细胞增殖、组织再生等，目前在肿瘤细胞增殖中研究较多，且YAP广泛存在于机体各主要细胞中，但YAP是否调控鼻息肉细胞非正常的增殖则未见报道，故本研究旨在检测YAP在鼻息肉组织中表达情况并初步探讨YAP是否与鼻息肉细胞增殖有关[48]。

对象与方法

一、研究对象

鼻息肉标本27例，来自2017年1月至5月在我院住院手术治疗的CRSwNP患者，诊断标准严格按照2012年欧洲鼻窦炎和鼻息肉指南[9]。男21例、女6例，年龄（3454±1167）岁。所有患者术前至少4周内无全身或局部使用过任何激素类药物。另取下鼻甲黏膜13例作对照组，其中男11例、女2例，年龄（4193±1384）岁，该标本来自脑脊液鼻漏、视神经管骨折或慢性泪囊炎等患者，因术中暴露解剖结构的需要而切除的正常下鼻甲（表1）。所有患者均已签署知情同意书，并且已获得医院医学伦理委員会同意。

表1患者临床特点汇总表组别男∶女年龄病程对照组11∶23454±1167373±165CRSwNP组21∶64193±1384423±221t值--1658-0718P值1000a01050477注：aFisher确切概率法

二、方法

1标本采集与处理

采集对照组下鼻甲或实验组鼻息肉组织1份，用生理盐水洗去血迹和分泌物后，把组织浸润于RNALater中并剪碎，4℃过夜，吸取RNALater后，-80℃保存，备qRTPCR。分别检测各组织中YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的表达。

2实时荧光定量PCR检测方法

组织在液氮中研磨后，采用Trizol试剂提取组织总RNA，以1 μg RNA为模板，逆转录合成cDNA，两步法逆转录反应： 42℃ 2 min去除基因组DNA； 37℃ 15 min，85℃ 5 s逆轉录。三步法实时荧光定量PCR反应：95℃ 5 min预变性；95℃ 15 s退火，60℃ 15 s解链，72℃ 32 s延伸，40个循环。引物序列见表2。结果分析：ΔCT= （ΔCT。xΔCT β2M），基因相对表达量=2ΔCT，其中x为目标基因，β2M为内参。

三、统计学处理

采用SPSS 200软件进行数据分析。计量资料不符合正态分布，以中位数（四分位数间距）表示。2组性别的组间差异采用Fisher确切概率法，年龄和病程的组间差异采用两组独立样本t检验。CRSwNP组与对照组的YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的表达差异采用MannWhitney检验。CRSwNP组的YAP mRNA与TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA之间的相关性采用Spearman秩相关分析。P<005为差异有统计学意义。

结果

一、YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA在鼻息肉和正常下鼻甲组织中的表达水平

CRSwNP组鼻息肉组织和对照组下鼻甲均可检测到YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA表达（表3）。CRSwNP组中各指标的表达均高于对照组，2组比较差异有统计学意义（P均<005）。

二、YAP mRNA分别与TEAD1、TSLP、IL33和Ki67 mRNA之间的相关性分析

Spearman秩相关性分析表明，在鼻息肉组织中（n=27），YAP mRNA相对表达水平与TEAD1 mRNA相对表达水平呈正相关（rs=0568；P=0002，图1A）；YAP mRNA相对表达水平与TSLP mRNA相对表达水平呈正相关（rs=0693；P<0001，图1B）； YAP mRNA相对表达水平与IL33 mRNA相对表达水平呈正相关（rs=0745；P<0001，图1C）；YAP mRNA相对表达水平与Ki67 mRNA相对表达水平呈正相关（rs=0561；P=0002，图1D）。

讨论

鼻息肉形成的发病机制目前尚未完全清楚，鼻息肉上皮细胞增殖过度活跃是鼻息肉典型的病理特征之一。Ki67是细胞增殖的重要标记，本研究中发现鼻息肉组织中Ki67表达水平高于对照组的鼻黏膜组织，且差异有统计学意义，提示鼻息肉组织的细胞增殖活性高于正常鼻黏膜组织，符合鼻息肉上皮增生、间质水肿，腺体增多的病理状态，也与Zhao等[10]研究结果相符。但正常的鼻黏膜如何发

表3YAP、TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA在对照组下鼻甲及

鼻息肉组织中的表达水平中位数（四分位数间距）组别YAPTEAD1TSLPIL33Ki67对照组0372（0388）0176（0182）0017（0033）04390（0366）0008（00115）CRSwNP组290（267）0322（1032）0047（013）0703（0983）0066（0081）Z值-4260-2469-2744-3119-4232P值<000100130005<0001<0001

图1鼻息肉组织中YAP与TEAD1、TSLP、IL33和Ki67的mRNA的相关性分析展成鼻息肉以及鼻息肉细胞过度增殖又是如何被调控的目前研究较少。有研究发现鼻息肉组织中存在凋亡相关蛋白Fas、FasL和Ki67的平衡失调，鼻息肉细胞凋亡抑制而增殖活性加强从而导致上皮组织增生、重塑[1112]。也有研究发现嗜酸性粒细胞浸润导致鼻黏膜组织损伤，病理状态下上皮修复从而导致组织增生[1315]。但这些研究并未解答鼻息肉组织中Ki67活性是如何被调控增强从而使鼻息肉细胞增殖过度活跃最后导致组织增生。

YAP是Hippo通路的主要蛋白，在调控细胞增殖、凋亡和组织大小等方面发挥重要作用。该通路主要由哺乳动物 STE20 样激酶1/2（MST1/2）和磷酸化肿瘤抑制基因（LATS1/2）组成的激酶级联激活，最终使 Hippo信号通路的主要效应转录因子YAP和具有 PDZ 结合基序的转录辅激活物（TAZ）去磷酸化入核，然后结合转录因子TEAD14，从而转录调控基因的转录水平参与细胞的增殖、分化和死亡等[4]。目前YAP在肿瘤方面研究较多，有学者发现在肝癌组织中Hippo通路活化，YAP表达增加可使Ki67表达增加从而使肝癌细胞增殖活跃，提示机体在病理状态下可由YAP调控Ki67表达从而使细胞增殖过度活跃[16]。但在鼻息肉组织中YAP是否与Ki67表达有关则未见报道。

本研究通过检测鼻息肉组织中YAP及其核内转录因子TEAD1 mRNA相对表达水平，发现鼻息肉组织中YAP及TEAD1表达均比对照组高，提示病理状态下鼻黏膜组织中YAP激活。本研究接着探讨鼻息肉组织中YAP活化是否与细胞过度增殖有关，通过分析鼻息肉组织中YAP和Ki67 mRNA相对表达水平的相关性，发现两者呈正相关，提示鼻息肉细胞增殖过度活跃与YAP有关，即YAP参与了鼻息肉的形成机制，调控细胞过度增殖导致组织增生。

鼻息肉形成与上皮受损激发炎症反应有关，近年来研究发现鼻黏膜上皮受到刺激后可分泌TSLP、IL33等固有免疫因子[2， 1720]。因此，本研究还进一步探讨TSLP、IL33等因子是否与YAP调控Ki67从而使细胞增殖过度活跃有关，发现鼻息肉组织中TSLP、IL33的mRNA相对表达水平较对照组高，且均与YAP高表达呈正相关，提示鼻息肉组织中YAP活化可能与上皮受损释放TSLP、IL33等因子有关。

Hippo通路作为一种控制组织和器官大小的新型信号转导途径，目前在鼻黏膜慢性炎症发病中仍未见报道。本研究通过检测鼻息肉YAP、TEAD1、Ki67、TSLP、IL33等mRNA表达水平，发现鼻息肉中存在Hippo通路的活化，再进一步发现YAP与Ki67表达增加呈正相关，初步提示鼻息肉中细胞过度增殖与YAP有关。同时鼻黏膜上皮受损后释放的TSLP、IL33表达上调也与YAP正相关，表明鼻黏膜上皮受损可能活化了YAP的活性，從而介导细胞、组织的过度增殖，但具体机制仍需更多的研究进一步证实。

参考文献

[1]王涛， 李鹏， 杨钦泰， 刘贤， 张革化 复发性鼻窦炎伴鼻息肉患者功能性鼻内镜术后布地奈德的应用及疗效观察 新医学， 2011， 42（11）：756758

[2]Stevens WW， Lee RJ， Schleimer RP， Cohen NA Chronic rhinosinusitis pathogenesis J Allergy Clin Immunol， 2015， 136（6）： 14421453

[3]Meng J， Zhou P， Liu Y， Liu F， Yi X， Liu S， Holtappels G， Bachert C， Zhang N The development of nasal polyp disease involves early nasal mucosal inflammation and remodelling PloS One， 2013， 8（12）： e82373

[4]Yu FX， Guan KL The Hippo pathway： regulators and regulations Genes Dev， 2013， 27（4）： 355371

[5]Yu FX， Zhao B， Guan KL Hippo pathway in organ size control， tissue homeostasis， and cancer Cell， 2015， 163（4）： 811828

[6]Zhou B， Comeau MR， De Smedt T， Liggitt HD， Dahl ME， Lewis DB， Gyarmati D， Aye T， Campbell DJ， Ziegler SF Thymic stromal lymphopoietin as a key initiator of allergic airway inflammation in mice Nat Immunol， 2005， 6（10）： 10471053

[7]von Gise A， Lin Z， Schlegelmilch K， Honor LB， Pan GM， Buck JN， Ma Q， Ishiwata T， Zhou B， Camargo FD， Pu WT YAP1， the nuclear target of Hippo signaling， stimulates heart growth through cardiomyocyte proliferation but not hypertrophy Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（7）： 23942399

[8]Schlegelmilch K， Mohseni M， Kirak O， Pruszak J， Rodriguez JR， Zhou D， Kreger BT， Vasioukhin V， Avruch J， Brummelkamp TR， Camargo FD Yap1 acts downstream of alphacatenin to control epidermal proliferation Cell， 2011， 144（5）： 782795

[9]Fokkens WJ， Lund VJ， Mullol J， Bachert C， Alobid I， Baroody F， Cohen N， Cervin A， Douglas R， Gevaert P， Georgalas C， Goossens H， Harvey R， Hellings P， Hopkins C， Jones N， Joos G， Kalogjera L， Kern B， Kowalski M， Price D， Riechelmann H， Schlosser R， Senior B， Thomas M， Toskala E， Voegels R， Wang de Y， Wormald PJ EPOS 2012： European position paper on rhinosinusitis and nasal polyps 2012 Rhinology， 2012， 50（1）： 112

[10]Zhao L， Li YY， Li CW， Chao SS， Liu J， Nam HN， Dung NTN， Shi L， Wang DY Increase of poorly proliferated p63+ /Ki67+ basal cells forming multiple layers in the aberrant remodeled epithelium in nasal polyps Allergy， 2017， 72（6）： 975984

[11]Heo KW， Park SK， Lee YM， Choe SH， Gu PM， Hong TU， Hur DY Methotrexate induces apoptosis in organcultured nasal polyps via the Fas pathway J Craniofac Surg， 2017， 28（3）： 806809

[12]靳红，赵春源，徐秀玉，孙亚男，李晓丹 脂肪酸合酶及其配体在鼻息肉组织中的表达 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志， 2004， 39（3）： 143146

[13]Kuhar HN， Tajudeen BA， Mahdavinia M， Gattuso P， Ghai R， Batra PS Inflammatory infiltrate and mucosal remodeling in chronic rhinosinusitis with and without polyps： structured histopathologic analysis Int Forum Allergy Rhinol， 2017，7（7）：679689

[14]Wang C， Lou H， Wang X， Wang Y， Fan E， Li Y， Wang H， Bachert C， Zhang L Effect of budesonide transnasal nebulization in patients with eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps J Allergy Clin Immunol， 2015， 135（4）： 922929

[15]Shimizu S， Kouzaki H， Ogawa T， Takezawa K， Tojima I， Shimizu T Eosinophilepithelial cell interactions stimulate the production of MUC5AC mucin and profibrotic cytokines involved in airway tissue remodeling Am J Rhinol Allergy， 2014， 28（2）： 103109

[16]Reis H， Bertram S， Pott L， Canbay A， Gallinat A， Baba HA Markers of Hippopathway activity in tumor forming liver lesions Pathol Oncol Res， 2017， 23（1）： 3339

[17]Liao B， Cao PP， Zeng M， Zhen Z， Wang H， Zhang YN， Hu CY， Ma J， Li ZY， Song J， Liu JX， Peng LY， Liu Y， Ning Q， Liu Z Interaction of thymic stromal lymphopoietin， IL33， and their receptors in epithelial cells in eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps Allergy， 2015， 70（9）： 11691180

[18]Nagarkar DR， Poposki JA， Tan BK， Comeau MR， Peters AT， Hulse KE， Suh LA， Norton J， Harris KE， Grammer LC， Chandra RK， Conley DB， Kern RC， Schleimer RP， Kato A Thymic stromal lymphopoietin activity is increased in nasal polyps of patients with chronic rhinosinusitis J Allergy Clin Immunol， 2013， 132（3）： 593600

[19]Baba S， Kondo K， Kanaya K， Suzukawa K， Ushio M， Urata S， Asakage T， Kakigi A， Suzukawa M， Ohta K， Yamasoba T Expression of IL33 and its receptor ST2 in chronic rhinosinusitis with nasal polyps Laryngoscope， 2014， 124（4）： E115E122

[20]Miljkovic D， Bassiouni A， Cooksley C， Ou J， Hauben E， Wormald PJ， Vreugde S Association between group 2 innate lymphoid cells enrichment， nasal polyps and allergy in chronic rhinosinusitis Allergy， 2014， 69（9）： 11541161

（收稿日期：20170606）

（本文編辑：杨江瑜）