超声辅助复配酶法制备黄姜中薯蓣皂素

肖婉娜 李欣 赖家良 赖航通 李子文 韩褒

摘要[目的]探讨超声辅助酶法水解黄姜生产薯蓣皂素工艺。[方法]通过正交试验优化纤维素酶和蜗牛酶组成的复配酶水解黄姜，建立高效液相色谱法定量薯蓣皂素，计算得率。[结果]酶解温度对薯蓣皂素得率的影响最大；最佳酶水解条件是酶解时间为48 h，酶添加量为物料的8%，酶解pH为6.0，酶解温度为50 ℃，薯蓣皂素的得率为0.524 9%。采用超声破碎辅助复配酶解法，薯蓣皂素的得率为0.630 9%。[结论]利用超声辅助纤维素酶和蜗牛酶提取黄姜中薯蓣皂素比直接酶解法得率提高了25%，接近酸解法的得率，应用潜力大。

關键词黄姜；薯蓣皂素；超声波辅助提取；蜗牛酶；纤维素酶

中图分类号S284.2文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）16-0121-05

Preparation Technology of Diosgenin of Dioscorea zingiberensis C.H.Wright by Ultrasonicassisted Coenzyme Hydrolysis

XIAO Wanna，LI Xin*，LAI Jialiang et al（Guangdong Polytechnic of Science And Trade，Guangzhou，Guangdong 510430）

Abstract[Objective]The research aimed to explore the preparation technology of diosgenin of Dioscorea zingiberensis by ultrasonicassisted coenzyme hydrolysis.[Method]The orthogonal experiment was carried out to optimize the cellulase and snail enzyme composition of the enzyme to hydrolyze the turmeric，and established HPLC method to determine the yield of diosgenin.[Result]The key factor affected extraction of diosgenin was enzymolysis temperature.The optimal condition for enzymatic hydrolysis were as follows：enzymolysis time of 48 h，enzyme dosage of 8%，enzymatic hydrolysis of pH 6.0，and enzymolysis temperature of 50 ℃.Thus，the yield of diosgenin prepared under those condition was up to 0.524 9%.Interestingly，the yield of diosgenin obtained by ultrasonic assisted coenzymatic hydrolysis was 0.630 9%.[Conclusion]The yield of diosgenin obtained by ultrasonic assisted coenzymatic hydrolysis increased by 25% compared with that obtained by the direct enzymatic hydrolysis，which was close to that obtained by the acidic hydrolysis.Thus，it plays a potential role in preparing diosgenin of Dioscorea zingiberensis.

Key wordsDioscorea zingiberensis C.H.Wright；Digestion；Ultrasonicassisted extraction；Snailase；Cellulase

黃姜，学名盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright），是我国传统中药材，常以根茎入药。薯蓣皂素，又称薯蓣皂苷元，是薯蓣属植物薯蓣皂苷的水解产物，是合成肾上腺皮质激素、性激素和蛋白质同化激素等甾体激素药物的原料[1]。薯蓣皂素在植物体内是以薯蓣皂苷配基形式存在、通过皂苷键与不同的糖基侧链相连，进而与植物细胞壁紧密连接。黄姜的根茎中薯蓣皂素通过糖苷键与糖类结合形成薯蓣皂苷存在于植物细胞壁中，甾体皂苷常被淀粉和纤维素包裹。工业上普遍采用无机酸水解工艺提取黄姜中薯蓣皂素，该法工艺简单、操作简便，但废水量极大，酸性强、环境污染严重，废渣中的淀粉和纤维素类物质因混有酸而难以利用，造成资源浪费，严重制约了薯蓣皂素产业的可持续发展[2-6]。

目前，国内对薯蓣皂素的酶和微生物转化法研究较多。微生物发酵法具有污染小、成本低的特点，缺点是薯蓣皂素转化率低。而酶水解断裂糖苷键专一性强，缺点是多数酶的成本较高，限制了其广泛应用[7-9]。鉴于此，笔者探讨采用廉价的纤维素酶和蜗牛酶复配水解黄姜超声波辅助提取薯蓣皂素的新工艺，以期为薯蓣皂素的工业化生产应用提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1原料。新鲜盾叶薯蓣，野生，产地四川广元。

1.1.2药品与试剂。薯蓣皂素标准品、中温淀粉酶、糖化酶购自上海阿拉丁生化科技公司；甲醇、乙腈购自德国默克公司；石油醚（90～120 ℃）、磷酸氢二钠、冰乙酸购自天津富宇精细化工公司；纤维素酶购自上海金穗生物科技有限公司；β-葡萄糖苷酶购自国药集团；蜗牛酶购自合肥志宏生物技术有限公司，其他试剂均为分析纯试剂。

1.1.3主要仪器设备。

高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）、水浴恒温振荡器（巩义市予华仪器公司）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器公司）、小型台式离心机（德国Sigma公司）、超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、电子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2试验方法

1.2.1原料的处理。将新鲜黄姜清洗去除泥沙切片，50 ℃烘干后打粉，过100目筛，备用。

1.2.2酸解法制备薯蓣皂素。

称取黄姜粉末1 g置于100 mL烧杯中，加入50 mL 2 mol/L硫酸溶液，90 ℃水浴酸解6 h，水解液于9 000 r/min离心10 min，离心2次，弃上清液，渣用100 mL石油醚90 ℃回流6 h，减压浓缩，将粗皂素80 ℃烘干，用甲醇定容至10 mL，0.45 μm滤膜过滤后作为供试品溶液备用。

1.2.3薯蓣皂素的定量方法——高效液相色谱法。

1.2.3.1对照品溶液的配制。准确称取9.4 mg薯蓣皂素标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL。

1.2.3.2流动相的选择。根据预试验结果，选取以下流动相进行采集：甲醇-水（80∶20）、甲醇-水（90∶10）、乙腈-水（80∶20）。

1.2.3.3波长的选择。色谱柱WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm），紫外检测波长分别选用200、203、206、208和 210 nm，流动相为乙腈-水（80∶20），流速1 mL/min。

1.2.3.4色谱柱的选择。选择WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱、WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）柱和NuAnalybacal Uranus C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱3種色谱柱，紫外波长为203 nm，流动相为乙腈-水（80∶20），流速1 mL/min。

1.2.3.5方法学考察。将薯蓣皂素对照品溶液稀释成4.7、47.0、94.0、235.0、470.0、705.0、940.0 μg/mL的标准溶液，进样测定。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，考察线性关系；吸取薯蓣皂素对照品溶液6份，分别测量峰面积，考察精密度；样品溶液于1、2、4、8、12、24 h分别测定1次，测量峰面积，考察稳定性；取对照品溶液6份，用已知薯蓣皂素含量的样品溶液定容，测量峰面积，计算回收率。

1.2.4酶解法制备薯蓣皂素。

1.2.4.1酶的筛选。称取黄姜粉，加水90 ℃糊化1 h，冷却，或不糊化处理，分别添加淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、蜗牛酶的1种或多种复配水解，水解结束后离心，弃上清液，渣用石油醚90 ℃回流提取6 h，减压浓缩、残渣用甲醇定容，进行液相色谱法检测，比较薯蓣皂素的得率，确定最优酶组合。

1.2.4.2酶解法单因素试验。根据“1.2.4.1”确定最优酶组合，进行蜗牛酶单因素试验，纤维素酶统一添加量为物料的4%，pH 5.0，温度50 ℃，反应48 h后灭活得预处理液。预处理液6份分别添加蜗牛酶量占物料的质量分数为4%，50 ℃振荡水解1、6、12、24、48、72 h，测薯蕷皂素得率，考察水解时间对薯蓣皂素的影响；预处理液5份，添加蜗牛酶量占物料的质量分数分别为1%、2%、4%、8%、10%，50 ℃振荡水浴48 h，测薯蓣皂素得率，考察酶添加量对薯蓣皂素得率的影响；预处理液5份，pH分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，添加蜗牛酶量占物料的质量分数为4%，50 ℃振荡水解48 h，测薯蓣皂素得率，考察酶反应pH对薯蓣皂素得率的影响；预处理液6份，添加蜗牛酶量占物料的质量分数为4%，分别于35、40、45、50、55、60 ℃的恒温振荡水浴锅中水解48 h，测薯蓣皂素得率，考察酶水解温度对薯蓣皂素得率的影响。

1.2.4.3酶解法正交试验。根据“1.2.4.2”的单因素试验结果，选择4因素3水平L9（34）进行正交试验。

1.2.4.4超声辅助酶解制备薯蓣皂素。将黄姜粉加水进行超声破碎后再加酶水解，超声条件为570 W，45 min，70 ℃。

2结果与分析

2.1薯蓣皂素的定量方法——高效液相色谱法

2.1.1流动相的选择。

考察不同比例甲醇-水等度洗脱对分离效果的影响，结果表明，甲醇比例越高，极性强的皂苷重叠得越严重，分离度越低；甲醇比例调低，分离度改善，但皂素峰出峰时间超过30 min，试剂消耗太多（图1a、b）。采用乙腈-水（80∶20）溶液作为流动相，皂苷分离良好，皂素出峰也快，峰型较尖锐（图1c）。同时，由于薯蓣皂苷为末端吸收，而乙腈的截止波长为190 nm[10]，在试验波长203 nm下有吸收，但低于甲醇的截止波长（205 nm），检测灵敏度更高，因此，选用乙腈-水（80∶20）为流动相。

2.1.2波长的选择。考察检测波长对峰面积和分离度的影响，结果显示，薯蓣皂素在200、203、206、208、210 nm处均有吸收，而在203 nm处响应值最高，故选取203 nm作为检测波长。

2.1.3色谱柱的选择。考察不同柱填料和柱长色谱柱的分离效果，在乙腈-水（80∶20）等度洗脱下，薯蓣皂素从WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱、WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）柱和NuAnalybacal Uranus C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱中的出峰时间分别为12.989、21.991和23.415 min（图2）。弱极性的薯蓣皂素在NuAnalybacal Uranus C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱中响应值最低，可能是柱子的填料对薯蓣皂素保留能力较强，用乙腈-水作为流动相无法将薯蓣皂素完全洗脱出。综合考量，选择WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱为分离定量色谱柱。

2.1.4方法学考察。从图3可看出，薯蓣皂素标准曲线的线性方程为y=7.530 9x-51.292（R2=0.998 7），表明该方法在4.7～940.0 μg/mL线性良好。

由于样品溶液中含有多种组分，采用反相高效液相色谱法测定薯蓣皂素比分光光度计法干扰少[10-11]。方法精密度试验RSD值为1.29%，稳定性试验RSD值为0.95%，平均回收率为97.81%，该方法精密度良好，测定样品溶液稳定，回收率高。

45卷16期肖婉娜等超声辅助复配酶法制备黄姜中薯蓣皂素

2.2酶解法转化制备薯蓣皂素

2.2.1酶的筛选。试验表明，不糊化的薯蓣皂素的得率比糊化的高（表1）。可能的原因是物料经过糊化后体积膨大、黏度上升，后期水解又产生了大量的糖，这些糖和添加的酶互相粘连，对酶反应起了抑制作用。淀粉酶组合糖化酶或纤维素酶水解糊化后的黄姜粉末，未检测到薯蓣皂素。蜗牛酶和纤维素酶组合对不糊化黄姜粉的水解效果最佳（表1）。目前仅少数几种酶如淀粉酶、糖苷酶、纤维素酶等用于水解薯蕷皂苷[12-15]，蜗牛酶和β-葡萄糖苷酶均有切割皂苷中游离端的葡萄糖、鼠李糖等糖基作用，并且蜗牛酶属于价格适中的酶种之一，已广泛应用于轻工纺织、食品工业等领域[16]，蜗牛酶具备水解生产薯蓣皂苷的应用潜力。因此确定复合酶组合为纤维素酶和蜗牛酶。

2.2.2酶解法单因素试验。薯蓣皂素的得率随反应时间的增加而增加，48 h达到最大值，之后，呈平稳下降趋势（图4）。

薯蓣皂素的得率随着酶用量的增加而增加，当添加量占物料的质量分数为8%时，薯蓣皂素的得率达到最大值，随后稳定下降（图5）。黃姜中皂苷与蜗牛酶的结合位点有限，当这些结合位点全部被酶占领后，过量的酶环绕在周围导致酶和底物的无效吸附，阻碍水解反应，从而引起得率下降。

水解液pH为4.0～6.0时，薯蓣皂素的得率呈上升趋势；pH为6.0时达最大，并稳定在6.0～7.0；pH为4.0和8.0时，薯蓣皂素的得率均低于0.2%（图6），可见蜗牛酶适合在中性偏酸的pH体系。

水解温度为35～50 ℃时，薯蓣皂素的得率随温度上升而增加， 50 ℃时达到最大值；超过50 ℃，蜗牛酶开始部分失活，产率急剧下降；到60 ℃几乎完全失活，薯蓣皂苷的得率仅0.03%（图7）。因此蜗牛酶的作用温度为35～50 ℃，最适为50 ℃。

2.2.3酶解法正交试验。选择酶解时间、酶添加量、酶解pH、酶解温度4个因素进行正交试验。从表2可看出，各因素对薯蓣皂素得率的影响从大到小依次为酶解温度、酶添加量、酶解时间、酶解pH，最佳组合是A2B2C2D2，即酶解48 h，酶添加量为物料的8%，酶解pH为6.0，水解温度为50 ℃。

按正交试验确定的最佳条件验证水解薯蓣皂素的得率为0.524 9%，是传统直接酸水解法（得率0.677 0%） 的77.53%。薯蓣皂苷在强酸的作用下，可以水解出薯蓣皂素、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖等，但酶的转化有专一性，蜗牛酶是一种复合酶，其所含酶种类未必对皂苷上所有的糖苷键均有酶切作用，因此较难实现对薯蓣皂苷的完全转化[17]。另外，该试验采用的黄姜原料的薯蓣皂素含量低于闫美屹[14]研究的结论，可能与品种以及采收时间有关[18]，需进一步研究筛选出薯蓣皂素含量高的黄姜原料。

2.3各种薯蓣皂素提取方法的比较

超声波辅助酶法提取薯蓣皂素的得率（0.630 9%）高于直接复合酶水解法（0.524 9%）约25%。超声波的辐射压强产生的强烈击碎效应，使黄姜中部分皂苷的结合状态发生改变，断裂了纤维素和淀粉与皂苷的连接，使部分被包裹的糖苷键裸露出来，酶解反应更容易进行，水解更充分[18]，另外，超声破碎技术将黄姜的细胞壁击碎，提高了水解效率，从而该方法的得率与直接酸水解的得率接近。但超声波辅助酶解技术比全料酸水解的得率（0.677 0%）略低，可能是前者有部分疏水皂苷没有提取到，或由于酶的专一性，部分糖苷键尚未完全水解，需要应用质谱或核磁技术进行确定，进一步筛选和开发特异性酶品种或其他转化技术，是今后的研究方向。

3结论

该研究利用纤维素酶和蜗牛酶组成的复配酶制备薯蓣皂素，建立了薯蓣皂素的液相色谱检测方法，分离柱为WondaSil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）柱，流动相为乙腈-水（80∶20），紫外检测波长为203 nm。该方法精密度良好，样品测定稳定性好，回收率高。提出了超声辅助复配酶解法的清洁生产技术，在复配酶解工艺中，酶解温度对皂素得率的影响最大，最佳酶水解条件是酶解时间为48 h，酶添加量为物料的8%，酶解pH为6.0，水解温度为50 ℃，薯蓣皂素的得率为0.524 9%。采用超声破碎辅助复配酶解法提取薯蓣皂素，比直接酶解法得率提高了25%，接近酸解法的得率，应用潜力大。

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