维生素C对藏西北绒山羊精液冷藏效果及其全基因组DNA甲基化的影响

宋天增　任子利　赵彦玲　吴玉江　徐亚欧　孙锋博

摘要：【目的】研究维生素C对4 ℃保存藏西北绒山羊精液效果及其全基因组DNA甲基化的影响，为高效利用藏西北绒山羊种公羊精液及推广其人工授精技术打下基础。【方法】假阴道人工采集藏西北绒山羊种公羊新鲜精液，用维生素B12进行4倍稀释后添加不同浓度的维生素C（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/mL），4 ℃保存24 h，观察统计其精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率，并通过实时荧光定量PCR检测精子全基因组DNA甲基化的情况。【结果】藏西北绒山羊精液4 ℃保存24 h后，以添加8.0 mg/mL维生素C的效果最佳，对应的精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率分别为（73.41±0.47）%、（58.89±0.88）%和（68.76±0.81）%，3个指标均极显著高于未添加维生素C的空白对照组（P<0.01）。添加8.0 mg/mL维生素C的藏西北绒山羊精子全基因组DNA甲基化水平与新鲜精液的接近，均显著低于未添加维生素C的冷藏精液（P<0.05）。【结论】原精液中添加2.0 mg/mL维生素C可降低4 ℃保存藏西北绒山羊精液的全基因组DNA甲基化异常水平，提高藏西北绒山羊精液冷藏效果。

关键词： 藏西北绒山羊；精液；维生素C；冷藏；DNA甲基化

中图分类号： S826.83 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0357-04

Abstract：【Objective】This study investigated the effects of vitamin C on Northwest Tibet Cashmere Goat semen preserved at 4 ℃ and levels of the complete genome DNA methylation， in order to lay a foundation for utilization of ram semen and promotion of artificial insemination technique in the future. 【Method】Fresh semen of ram of Northwest Tibet Cashmere Goat was collected using artificial Vagina. Vitamin C of different concentrations（0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 and 12.0 mg/mL） were added into the semen 4-time diluted with vitamin B12 and preserved at 4 ℃ for 24 hours. Sperm motility， acrosomal integrity and plasma membrabe integrity were observed and complete genome DNA methylation was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The Northwest Tibet Cashmere Goat semen after 24 hours preserved at 4 ℃ with 8.0 mg/mL vitamin C showed the best quality. Sperm motility was（73.41±0.47）%， acrosomal integrity（58.89±0.88）% and plasma membrabe integrity（68.76±0.81）%. The three indexes were higher than those of control which added no vitamin C（P<0.01）. At the same time， the level of sperm complete genome DNA methylation was close to that of fresh semen， and significantly lower than those of semen added no vitamin C（P<0.05）. 【Conclusion】Adding 2.0 mg/mL vitamin C in Northwest Tibet Cashmere Goat semen preserved at 4 ℃ can reduce the level of DNA methylation and increase the quality of sperm preserved at refrigeration temperature.

Key words： Northwest Tibet Cashmere Goat； semen； vitamin C； refrigeration； DNA methylation

0 引言

【研究意義】藏西北绒山羊又称克什米尔山羊（益西多吉等，2009），已完全适应高海拔地区（藏西北）缺氧、无霜期短、昼夜温差大、终年无补饲的恶劣自然条件，且产出的羊绒细度在14.5±0.5 μm，优于我国其他绒山羊品种（索朗达等，2015）。近年来，随着西藏特色农牧产业和畜禽良种工程等重点建设项目的启动，国家畜禽良种补贴等扶持政策相继落实，藏西北绒山羊良种需求日益增多，因此人工授精技术在藏西北绒山羊种公羊的高效利用中也倍受重视。【前人研究进展】维生素C是一种重要、有效的自由基清除剂，具有较强的还原性，参与有机体内的氧化还原反应，在畜禽精液的保存过程中发挥了重要作用（Jones and Mann，1977；赵宪林，2009）。Singh等（1996）在牛的冻精稀释液中添加25 mmol/L维生素C，能显著提高解冻后的精子活力，由原来的37.5%提高到46.0%。Aurich等（1997）向马的精液中添加0.9 mg/mL维生素C，发现维生素C能抑制精子代谢，从而延长精子的存活时间。Sánchez-Partida等（1997）向绵羊冻精解冻液中添加50和100 mmol/L维生素C，结果发现解冻后精子的代谢降低，存活时间明显延长，其原因可能是维生素C能有效防止精子磷脂发生过氧化，保护精子免受自由基的危害。赵宪林（2009）在牛精液稀释液中添加6.0 mg/mL维生素C，测得解冻后0 h的精子活力与新鲜精液无明显差异，表明维生素C添加浓度对解冻后的牛精子摆动幅度及鞭打频率等影响不明显。陈宗明等（2012）研究表明，添加3.0 mg/mL维生C可显著提高贵州黑山羊精液的4 ℃保存效果。郑自华等（2014）研究发现，在德保矮马精液冷冻稀释液中添加维生素C能有效延长精子的体外存活时间。杨波等（2014）研究发现，在兔精液稀释液中添加维生素C可提高常温保存的精液品质。任子利等（2016）研究表明，在精液稀释液中添加维生素C可降低藏猪精子基因组DNA甲基化异常水平，提高藏猪精液4 ℃保存的效果。【本研究切入点】长期以来，由于山羊冻精解冻后精子活力和受胎率较低等因素，严重制约了山羊冻精的大面积推广应用。在低温条件下，液态的山羊精液代谢水平较低，其保存时间较常温更长，且可应用普通冰箱4 ℃保存，经济方便。因此，进一步优化液态精液冷藏保存体系对提高山羊种公羊的利用率及推广其人工授精技术具有重要意义。【拟解决的关键问题】在以维生素B12对藏西北绒山羊进行4倍稀释的基础上添加不同浓度的维生素C，经4 ℃保存24 h后观察统计其精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率，探讨维生素C对藏西北绒山羊精液冷藏效果的影响，并通过实时荧光定量PCR检测精子全基因组DNA甲基化的情况，为高效利用藏西北绒山羊种公羊精液及推广其人工授精技术打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验公羊为3～5岁的健康藏西北绒山羊种公羊，共9只，假阴道人工采集其新鲜精液，以人用维生素B12进行4倍稀释。稀释后精液用8层以上纱布包裹于18 ℃培养箱中平衡2 h，再置于4 ℃下保存24 h。维生素C购自上海现代哈森（商丘）药业有限公司，考马斯亮蓝R 250购自上海展云化工有限公司、Diff-Quik Stain染液购自北京普博斯生物科技有限公司、精子基因组DNA提取试剂盒购自北京百奥森泰生物技术有限公司、MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）购自美国Epigentek公司。主要仪器设备：倒置荧光体视显微镜（IX73，奥林巴斯），电热恒温水槽（DKB-450A，上海森信实验仪器有限公司），变频冰箱（BCD-649WDVC，海尔）、DK-S28电热恒温水浴锅（上海精宏）、UV-1100紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、Multifuge X3高速低温离心机和ELx808吸收光酶标仪（美国）。

1. 2 试验设计

1. 2. 1 维生素C对4 ℃保存藏西北绒山羊精液品质的影响 向维生素B12 4倍稀释的藏西北绒山羊精液中添加不同浓度的维生素C（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/mL），4 ℃下保存24 h后观察统计其精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率，探析添加维生素C对4 ℃保存藏西北绒山羊精液品质的影响。3次重复。

1. 2. 2 维生素C对4 ℃保存藏西北绒山羊精子全基因组DNA甲基化的影响 根据1.2.1筛选出维生素C最佳添加浓度组（A），同时设新鲜精液组（B）和未添加维生素C组（C）。通过实时荧光定量PCR检测不同处理组的精子全基因组DNA甲基化情况，探析维生素C对4 ℃保存藏西北绒山羊精子全基因组DNA甲基化的影响。3次重复。

1. 3 测定项目及方法

1. 3. 1 精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率测定 精子活力常规性状参照林嘉鹏等（2015）、唐淑红等（2015）的方法进行检查，精子顶体完整率和精子质膜完整率参照胡传活等（2015）的方法进行评价。

1. 3. 2 精子全基因组 DNA甲基化水平检测 采用精子基因组DNA提取试剂盒提取不同处理组的精子全基因组DNA，以UV-1100紫外可见分光光度计检测其浓度和纯度，以琼脂糖凝胶电泳检测条带的清晰度和整齐性。同时，参照MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）说明绘制标准曲线，计算藏西北绒山羊精液样品的DNA甲基化水平。

1. 4 统计分析

试验数据采用Excel 2010进行整理，再以SPSS 11.5进行One-way ANOVA方差分析及Duncans多重比较。

2 结果与分析

2. 1 维生素C对藏西北绒山羊精液4 ℃保存效果的影响

由表1可看出，藏西北绒山羊精液经4 ℃保存24 h后，添加维生素C处理组的精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率均高于空白对照组，且随着维生素C添加浓度的增加，精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率呈先升高后降低的变化趋势。其中，以添加8.0 mg/mL维生素C的效果最佳，对应的精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率分别为（73.41±0.47）%、（58.89± 0.88）%和（68.76±0.81）%，3个指标均极显著高于未添加维生素C的空白对照组（P<0.01）。

2. 2 藏西北绒山羊精子基因组DNA纯度检测结果

以UV-1100紫外可见分光光度计分别检测维生素C最佳添加浓度（8.0 mg/mL）组（A）、新鲜精液组（B）和未添加维生素C组（C）的藏西北绒山羊精子全基因组DNA，结果表明，藏西北绒山羊精子全基因组DNA浓度为325±10 ng/μL、纯度为1.9～2.0，DNA瓊脂凝胶电泳条带整齐、清晰、单一（图1）。将待检藏西北绒山羊精子全基因组DNA稀释至100 ng/μL后备用。

2. 3 维生素C对藏西北绒山羊精子基因组DNA甲基化的影响

2. 3. 1 标准曲线制作 参照MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）的说明，以5-甲基胞嘧啶（5-mC，50%）含量为横坐标、相对荧光单位为纵坐标绘制标准曲线（图2），拟合得到回归方程：y=1127.6x+128.8（R2=0.9978）。由图2可看出，拟合的回归方程线性关系良好，可用于计算5-mC含量及DNA甲基化水平。

2. 3. 2 维生素C对藏西北绒山羊精子全基因组DNA甲基化水平的影响 维生素C最佳添加浓度（8.0 mg/mL）组（A）、新鲜精液组（B）和未添加维生素C组（C）的藏西北绒山羊精子全基因组DNA甲基化水平如图3所示，以C组的DNA甲基化水平最高，显著高于A组和B组（P<0.05），而A组与B组差异不显著（P>0.05）。表明添加8.0 mg/mL维生素C可有效降低低温（4 ℃）对藏西北绒山羊精子DNA甲基化的影响，改善藏西北绒山羊精液低温冷藏的效果。

3 讨论

本研究结果表明，随着维生素C添加量的增加，4 ℃保存藏西北绒山羊精液的精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率指标呈先升高后降低的变化趋势（抛物线），其中以添加8.0 mg/mL维生素C的效果最佳，对应的精子活力、精子顶体完整率和质膜完整率分别为（73.41±0.47）%、（58.89±0.88）%和（68.76±0.81）%，3个指标均极显著高于其他处理组。本研究在添加维生素C前先用维生素B12进行4倍稀释，相当于原精液中的维生素C最佳添加量为2.0 mg/mL，与陈宗明等（2012）在原精液中添加3.0 mg/mL维生素C可显著提高云贵高原4 ℃保存贵州黑山羊精液冷藏效果的结果基本一致。相差的1.0 mg/mL添加量可能与所处环境大气压、含氧量、环境湿度等影响冷藏产生的活性氧有关，但具体原因有待进一步探究。

Benchaib等（2005）将人类精子经免疫组化染色后通过流式细胞仪进行定量分析，发现在辅助生殖过程中的精子全基因组DNA甲基化水平可作为研究人类精子是否具有受孕能力的一种新方法。人类精子DNA片段化与全基因组DNA甲基化间存在负相关，添加抗氧化剂可减少DNA损伤且确保精子DNA甲基化状态正常（Tunc and Tremellen，2009）。本研究结果表明，添加8.0 mg/mL维生素C可有效降低低温（4 ℃）保存环境对藏西北绒山羊精子全基因组DNA甲基化的影响，改善藏西北绒山羊精液低温冷藏的效果，与任子利等（2016）在藏猪精液稀释液中添加维生C可降低藏猪精子基因组DNA甲基化异常水平，提高藏猪精液4 ℃环境保存的效果一致。说明维生素C对藏西北绒山羊精子全基因组DNA具有较强的还原性，可清除因冷藏产生的自由基（Jones and Mann，1977；赵宪林，2009），还可有效防止精子磷脂发生过氧化，降低基因组DNA甲基化水平，保护精子免受自由基的危害。

4 结论

原精液中添加2.0 mg/mL维生素C可降低4 ℃保存藏西北绒山羊精液的全基因组DNA甲基化异常水平，提高藏西北绒山羊精液冷藏效果。

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（責任编辑 兰宗宝）