云南省部分烟区根结线虫形态和分子鉴定

杨艳梅　梁艳　袁绍杰　赵希城　胡先奇

摘要：【目的】明确当前云南省部分烟草种植区根结线虫的种类和分布，为烟草根结线虫病综合防治及烟草品种布局提供理论依据。【方法】2015年8～10月，在云南省主要烟草种植区昆明、曲靖和玉溪市采集54份烟草根结线虫病根样本，采用雌成虫会阴花纹形态观察及分子生物学检测（rDNA-ITS区和SCAR特异性鉴定）对病原根结线虫种类进行鉴定。【结果】采集的54份样本中有24份样本的病原为花生根结线虫（Meloidogyne arenaria），占44.44 %；7份样本为南方根结线虫（M. incognita），占12.96%；1份样本为爪哇根结线虫（M. javanica），占1.85%；11份样本为爪哇根结线虫和花生根结线虫的复合种群，占20.37%；5份样本为南方根结线虫和花生根结线虫的复合种群，占9.26%；3份样本为南方根结线虫和爪哇根结线虫的复合种群，占5.56%；3份样本为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种线虫的复合种群，占5.56 %。【结论】当前危害云南省部分烟草种植区（昆明、曲靖和玉溪烟区）的根结线虫种类主要有南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种，以花生根结线虫为优势种群。

关键词： 烟草；根结线虫；种类；云南

中图分类号： S432.45 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0284-08

Abstract：【Objective】The present study investigated species and distribution of root-knot nematodes in tobacco growing regions of Yunnan， in order to provide reference for comprehensive prevention of root-knot nematodes disease and tobacco variety layout. 【Method】During August to October， 2015， 54 samples of root-knot nematode host on tobacco crops were collected from Kunming city， Qujing city and Yuxi city in Yunnan. The species of root-knot nematodes were identified by observing perineal patterns and molecular biological testing（PCR of ITS region of ribosomal DNA and sequence characterized amplified region， SCAR）. 【Result】There were 24 samples belonging to Meloidogyne arenaria， accounting for 44.44%； seven M. incognita samples， accounting for 12.96%； one M. javanica sample， accounting for 1.85%. Eleven samples were compound population of M. javanica and M. arenaria， accounting for 20.37%. Five were compound population of M. incognita and M. arenaria， accounting for 9.26%. Three were compound population of M. incognita and M. javanica， accounting for 5.56%. Three belonged to compound population of M. incognita， M. javanica and M. arenaria， accounting for 5.56%. 【Conclusion】The species of root-knot nematodes in tobacco growing areas of Yunnan mainly include M. incognita， M. javanica and M. arenaria. M. arenaria is the dominant population.

Key words： tobacco； root-knot nematode； species； Yunnan

0 引言

【研究意義】烟草是一种重要的经济作物，为我国财政资金积累作出了重要贡献，在反哺农业中也发挥着不可替代的作用。生产上烟草深受根结线虫危害，烟株受害后，初期植株整体矮化，生长缓慢，后期根部形成“鸡爪状”，烘烤出的烟叶叶片薄，质量下降（吴杰，2014）。云南省是烟草生产和消费大省，但由于烟草连年种植，致使根结线虫病发生为害日趋严重，一般可造成减产10%～20%，严重的可达30%以上，甚至绝产（秦公伟等，2006）。此外，根结线虫的侵染还会加重其他烟草根茎病如黑胫病的为害（孔凡玉等，1995），烟草根结线虫病已成为制约烟草生产的重要因子。因此，对云南省烟草主要种植区根结线虫种类进行鉴定，对指导烟草种植区根结线虫病的综合防治具有重要意义。【前人研究进展】烟草根结线虫首次被发现于印度尼西亚的爪哇岛，1922年Tisdale发现美国佛罗里达根结线虫严重危害烤烟生产（Sasser et al.，1983）。在我国，余茂勋最早报道了烟草根结线虫病（孔凡玉和王静，2001）。目前，我国烟草产区几乎都有烟草根结线虫发生和为害的报道。李庆平（1995）研究表明，危害云南省楚雄州烟草的根结线虫种类主要有南方根结线虫和北方根结线虫，优势种为南方根结线虫。杨铭等（1995）通过会阴花纹鉴定发现危害云南烟草的根结线虫为4种常见种，以南方根结线虫为优势种群，其中北方根结线虫出现于海拔1900～2000 m的滇北亚热带（年均气温14.4～14.7 ℃）。陈永芳等（1997）采用形态学、鉴别寄主试验及生物化学方法对云南省103份烟草样本进行鉴定，结果共发现3种根结线虫，分别为花生根结线虫2号小种、爪哇根结线虫和南方根结线虫1号小种。董莹等（2014）采用会阴花纹、同工酶及SCAR分析对云南省耿马县的7份样本进行鉴定，结果表明，危害耿马县的根结线虫主要有花生根结线虫和爪哇根结线虫。马俊平等（2014）通过形态学、rDNA-D2/D3和SCAR分析对滇中引种美烟品种55个烟草根结线虫病样本进行鉴定，结果显示滇中引种美烟品种主产区的根结线虫为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种，优势种为爪哇根结线虫。【本研究切入点】有关云南省烟草根结线虫种类鉴定的文献报道虽较多，但大多集中在20世纪90年代。近年来，云南不断引进一些烤烟新品种，当地烟草主栽品种布局发生新的变化，这些新变化是否导致根结线虫种类发生变化尚不明确。【拟解决的关键问题】采用形态学与分子生物学方法相结合对云南省烟草主要种植区根结线虫种类进行鉴定，以明确当前云南烟草种植区的根结线虫种类及分布，分析优势种群的发生情况，为云南省烟草根结线虫的有效防治提供理论依据，也为烟草品种布局提供参考。

1 材料与方法

1. 1 田间采样

2015年8～10月，在云南省烟草主要种植区昆明、曲靖和玉溪市共采集54份烟草根结线虫病根样本，其中昆明16份、曲靖18份、玉溪20份，带回实验室进行样本保存及根结线虫种类鉴定。样本信息见表1。

1. 2 雌成虫会阴花纹制作及观察

参考Hartman和Sasser（1985）、Hirschmann（1985）的方法制作根结线虫会阴花纹，制作好的会阴花纹玻片用指甲油封片，贴好标签，于显微镜下拍照观察。

1. 3 分子生物学鉴定

1. 3. 1 根结线虫DNA提取 线虫DNA提取参照Adam等（2007）的方法并略有改进。用单头根结线虫成熟雌虫提取DNA。

1. 3. 2 rDNA-ITS区PCR扩增 采用Vrain等（1992）设计的通用引物V5367/F195进行根结线虫rDNA的ITS区PCR扩增。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物系列：V5367（5′-TTGATTACGTCC

CTGCCCTTT-3′），F195（5′-TTTCACTCGCCGTTACT

AAGG-3′）。PCR反应体系（50.0 μL）：模板DNA 5.0 μL，10×PCR Buffer（Mg2+，Plus）5.0 μL，dNTP（Mixture）4.0 μL，V5367（10 μmol/L）2.0 μL，F195（10 μmol/L）2.0 μL，Tap酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环； 72 ℃ 延伸10 min。扩增反应结束后，取6.0 μL扩增产物与2.0 μL 6×Loading Buffer混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下观测拍照。

1. 3. 3 根结线虫SCAR特异性鉴定 通过查找文献筛选出4对特异性引物（表2），对供试样本进行单引物PCR扩增。PCR反应体系（25.0 μL）：2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL，引物1（10 μmol/L）1.0 μL，引物2（10 μmol/L）1.0 μL，模板DNA 2.0 μL。扩增程序： 94 ℃预变性2 min； 94 ℃ 30 s，退火30 s（Finc/Rinc：55 ℃；Fjav/Rjav：64 ℃；Ma-F/Ma-R：61 ℃；Mh-F/Mh-R：61 ℃），72 ℃ 1 min，进行40个循环；72 ℃延伸10 min。扩增反应结束后，取6.0 μL扩增产物与2.0 μL 6×Loading Buffer混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并在照胶仪下观测拍照。

2 结果与分析

2. 1 雌成虫会阴花纹形态学鉴定结果

对云南省昆明、曲靖和玉溪市烤烟种植区采集的54份烟草根结线虫寄主样本进行雌成虫会阴花纹观察，经初步鉴定，54份烟草样本中有24份样本为花生根结线虫；7份为南方根结线虫；1份为爪哇根结线虫；11份为爪哇根结线虫和花生根结线虫的复合种群；5份为南方根结线虫和花生根结线虫的复合种群；3份为南方根结线虫和爪哇根结线虫的复合种群；3份为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种线虫的复合种群；混合种群共22份（图1）。

南方根结线虫雌虫会阴花纹：会阴花纹变异大，大多数有明显高的背弓，似方形或梯形；线纹较粗呈波浪狀，侧线有或无，不明显，有一些弯向阴门的线纹（图1-A、图1-B）。爪哇根结线虫雌虫会阴花纹：具有把花纹分成背区和腹区的明显的沟形侧线（侧沟），极少有线纹通过侧沟，背弓低圆或略高；线纹平滑或稍波浪状（图1-C、图1-D）。花生根结线虫雌虫会阴花纹：花纹变异较大，侧线附近有由稍呈锯齿状的背线形成的肩状突起，背弓较低、扁平至圆形；线纹粗平滑或稍波浪状，背线和腹线在侧线处交叉相遇（图1-E、图1-F）。

2. 2 rDNA-ITS区PCR扩增产物电泳检测结果

采用通用引物V5367/F195扩增54份烟草根结线虫rDNA的ITS区，对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，供试的所有种群在此区域均产生约760 bp大小的片段，表明供试种群在此区域的扩增片段差别甚微，通过电泳检测无法将其区分（图2）。

2. 3 SCAR特异性引物扩增产物电泳检测结果

选用4对特异性引物进行SCAR特异性鉴定，结果显示，选用Finc/Rinc引物进行PCR扩增，共有18个种群扩增出条带，条带大小约1200 bp；选用Fjav/Rjav引物进行PCR扩增，共有18个种群扩增出条带，条带大小约700 bp；选用Ma-F/Ma-R特异性引物进行扩增，共有43个种群扩增出条带，条带大小约420 bp；其中，11份样本为爪哇根结线虫和花生根结线虫的复合种群，5份样本为南方根结线虫和花生根结线虫的复合种群，3份样本为南方根结线虫和爪哇根结线虫的复合种群，3份样本为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种线虫的复合种群（图3）。

2. 4 形态学与分子生物学方法相结合综合鉴定结果

从上述分析结果可知，采用雌虫会阴花纹形态特征的鉴定结果与结合通用引物V5367/F195扩增产物片段大小、SCAR特异性鉴定的结果一致。采集的54份烟草根结线虫病害样本的病原线虫分别是：花生根结线虫24份，占44.44%；南方根结线虫7份，占12.96%；爪哇根结线虫1份，占1.85%；爪哇根结线虫和花生根结线虫的复合种群11份，占20.37%；南方根结线和花生根结线虫的复合种群5份，占9.26%；南方根结线虫和爪哇根结线虫的复合种群3份，占5.56%；南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种线虫的复合种群3份，占5.56%；混合种群共22份，占40.74%。从分布上看，3种根结线虫均遍布各采集地点，其中，昆明市所采集的16份样本中，有4份为南方根结线虫单独侵染，6份为花生根结线虫单独侵染，2份为南方根结线虫与花生根结线虫混合侵染，1份为爪哇根结线虫与花生根结线虫混合侵染，3份为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫混合侵染；曲靖市所采集的18份样本中，有2份为南方根结线虫单独侵染，1份为爪哇根结线虫单独侵染，5份为花生根结线虫单独侵染，2份为南方根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染，2份为南方根结线虫与花生根结线虫混合侵染，6份为爪哇根结线虫与花生根结线虫混合侵染；玉溪市所采集的20份样本中，有2份为南方根结线虫单独侵染，13份为花生根结线虫单独侵染，4份为爪哇根结线虫与花生根结线虫混合侵染，1份为南方根结线虫与爪哇根结线虫混合侵染。

3 讨论

利用形态学和分子生物学方法相结合进行根结线虫种类鉴定是当前国内外研究者常采用的一种方法，其准确性和客观性已得到国际公认。本研究采用形态学和分子生物学方法相结合鉴定出云南省昆明、曲靖和玉溪烟区根结线虫种类主要有花生根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫，从分布上来看，这3种根结线虫均遍布各采集地点，其中，花生根结线虫均为这3个地区的优势种群，但每个地区所采样本数量较少，无法对各自占有比例做出准确判定，有待后续研究。

烟草根结线虫病作为一种世界性病害严重制约烟草生产，世界范围内发现危害烟草的根结线虫主要有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫和高弓根结线虫5种（Taylor and Sasser， 1978）。我国烟草上5种根结线虫均有发现，以南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫为主要种群，北方根结线虫和高弓根结线虫只在少数地区发现。孔凡玉等（2000）研究表明，南方根结线虫1号小种、爪哇根结线虫和花生根结线虫2号小种为山东省烟草根结线虫主要病原，南方根结线虫1号小种为优势种群；李锡宏等（2002）和李建立等（2012）鉴定出湖北省烟草根结线虫病原为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫；朱斌等（2005）研究表明陕西省陕南烟区根结线虫病原物为南方根结线虫；王仁刚等（2007）研究表明贵州省烟草根结线虫有南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种；焦永吉等（2014）检测出河南省烟草根结线虫有4种，分别为南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫和爪哇根结线虫，优势种群为南方根结线虫。云南烟草根结线虫最早在1991年初见报道，1991～1995年相关研究表明云南烟草根结线虫种类有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫4种常见种，且以南方根结线虫为优势种群（秦西云等，1991；李庆平，1995；杨铭等，1995）；1997～1998年研究显示南方根结线虫已由云南烟草根结线虫的优势种群下降为次要种群，花生根结线虫上升为优势种群（陈永芳等，1997；喻盛甫等，1998）；2013～2014年，相关研究发现南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫依然为云南省烟草根结线虫主要种群，其优势种群在局部地区显示不一（徐兴阳等，2013；董莹等，2014；马俊平等，2014）。

本研究结果显示，危害云南烟草的根结线虫种类（南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫）与我国烟草上主要根结线虫种类相符，研究未发现有北方根结线虫存在，可能是本研究采集点的气候条件不适于北方根结线虫所需的寒冷气候所致（张绍升，1991）。本研究鉴定结果显示花生根结线虫为优势种群，与河南省、山东省、陕西省及云南省1991～1995和2013年报道的烟草根结线虫以南方根结线虫为优势种群的研究结果不符，且与马俊平等（2014）报道的滇中美烟品种根结线虫优势种群为爪哇根结线虫的研究结果也不相符，但与云南省1997～1998年及董莹等（2014）报道的云南省其他烟草种植区烟草根结线虫以花生根结线虫为优势种群的研究结果相符。相关研究显示，烟草品种K326属抗南方根结线虫品种，但对爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫均感病；红花大金元对南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫均感病（陈永芳等，1997；喻盛甫等，1998）。本研究所收集的烟草品种主要包括红花大金元和K326，两品种所占比例分别为22.22%和53.70%，即K326占所收集样本的一半以上，可能是本研究根结线虫优势种群发生变化的主要原因。本研究54份煙草样本中有12份样本为红花大金元，29份样本为K326。12份红花大金元样本中，5份样本检出南方根结线虫单独侵染，2份样本检出花生根结线虫单独侵染，2份样本检出南方根结线虫和花生根结线虫混合侵染，2份样本检出南方根结线虫和爪哇根结线虫混合侵染，1份样本检出爪哇根结线虫和花生根结线虫混合侵染，可见，红花大金元对3种根结线虫均感病。29份K326样本中，2份样本检出南方根结线虫单独侵染，19份样本检出花生根结线虫单独侵染，1份样本检出南方根结线虫和花生根结线虫混合侵染，1份样本检出南方根结线虫和爪哇根结线虫混合侵染，5份样本检出爪哇根结线虫和花生根结线虫混合侵染，1份样本检出南方、爪哇和花生根结线虫混合侵染。可见，K326对爪哇根结线虫和花生根结线虫均感病。此外，29份K326样本中，有5份样本检出南方根结线虫，其中3份以混合侵染方式感染，可能是侵染性线虫的侵入使K326对南方根结线虫的抗性减弱所致。本研究结果表明，云南省烟草根结线虫混合发生侵染的比例上升，可能是由于近年来云南省新引进烟草品种的介入，寄主与病原的互作关系发生变化，打破了原有的种群结构，且基于大田采样，环境相对开放，利于线虫种群交流所致。

本研究结果可为抗病育种学家及生防工作者们今后开展对该烟区根结线虫的综合防控体系的建立提供参考依据。但由于时间的局限性，本研究仅鉴定到根结线虫种，未鉴定到其所属的生理小种范围，有待后续工作中进一步探讨。此外，鉴于本研究采样地点仅涉及云南省烟草主产区的昆明、曲靖和玉溪市，研究结果仅能反应云南省部分烟区的根结线虫种群分布情况，无法对整个云南省烟草种植区的根结线虫种类分布及占有比例做出最终判定，还有待进一步调查研究。

由于根结线虫不同种之间具有显著的致病性差异，因此，准确鉴定根结线虫显得尤为重要。根结线虫雌成虫会阴花纹形态观察虽然作为形态学鉴定的核心方法，但由于受寄主与营养的差异、年轻雌虫与老熟雌虫的不同等多种因素影响而存在一定程度的变异，故常造成鉴定结果的不确定性。根结线虫核糖体DNA的内转录间隔区（ITS）在种内具有高度保守性，在不同种间又表现不同程度的差异，是根结线虫种间鉴定的理想遗传标记区（王曦茁等，2013），但Powers等（1997）发现南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种根结线虫的ITS区系列非常保守；Blok等（1997）也发现南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种根结线虫ITS区片段差别甚微，本研究结果也与之相符，故单用ITS系列进行根结线虫种类鉴定也不可行。SCAR特异性鉴定技术使用的引物长、退火温度高，因而稳定性好，被广泛应用于根结线虫种类鉴定。Wiliamson等（1997）采用SCAR鉴定方法设计了1对特异性引物，快速准确鉴定了M. haple；Carolien等（2000）基于SCAR-PCR设计了3对特异性引物，准确鉴定出南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫。本研究采用SCAR特异性鉴定技术进行根结线虫种类鉴定不失为一种简便、快速的鉴定方法，再结合ITS及会阴花纹综合测定使得鉴定结果更为准确、可靠。

4 结论

本研究采用形态学与分子生物学方法有机结合对所采集样本进行鉴定，结果表明，当前危害云南省部分烟草种植区（昆明、曲靖和玉溪烟区）的根结线虫种类主要有南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种，且花生根结线虫已上升为优势种群，成为影响该烟区烟草产业可持续发展的重要病害，并已对烟叶生产构成巨大危害。

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（責任编辑 麻小燕）