水稻细菌性条斑病的广谱抗性资源筛选

洪登伟　赵严　罗登杰　施力军　李容柏　刘芳

摘要：【目的】筛选在多个生育期对多个强致病力细菌性条斑病病菌具有广谱抗性的水稻材料，为水稻细菌性条斑病抗性品种的培育提供可靠抗源材料。【方法】以1100份具有丰富遗传背景的水稻品系为试验材料，以高感病品种金刚30为感病对照，以5株强致病力水稻细菌性条斑病病菌为接种对象，采用针刺法进行多生育期、多个强致病力细菌性条斑病菌菌株重复接种抗性筛选鉴定。【结果】初筛获得14份抗病材料，占全部材料的1.27%。复筛获得9份具有中抗级别以上的材料，占全部材料的0.82%，其中有3份材料（RL6、RL9和RL14）在水稻的3个生育期对多株水稻细条病菌菌株具有抗性，尤其是RL6表现出对多菌株的广谱抗性，且抗性水平高；6份材料（RL2、RL4、RL5、RL8、RL11和RL12）在单个生育期对单株水稻细条病菌菌株具有抗性。【结论】获得3份对水稻细菌性条斑病具有多生育期广谱抗性的材料，可作为重要的抗源应用于水稻抗性品种培育，其中RL6可作为优质抗源优先应用于水稻抗性品种培育；获得6份在特定生育期对水稻细菌性条斑病具有抗性的材料，可作为候选抗源应用于水稻抗性品种培育。

关键词： 水稻；细菌性条斑病；广谱抗性；抗性资源

中图分类号： S435；S511 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0272-05

Abstract：【Objective】Rice lines with broad-spectrum resistance toward several kinds of pathogenic bacteria of Xanthomans oryzae pv. Oryzicola at multiple growth stages were selected in order to provide source for rice bacterial leaf streak resistance breeding. 【Method】A total of 1100 rice lines with rich genetic background were offered as selective objects. Highly susceptible cultivar Jingang 30 was used as control. Inoculation was carried out on five strong pathogenic bacteria. Acupuncture method was used in resistance identification using multiple pathogenic strains at various growth stages. 【Result】Fourteen disease-resistant materials were obtained through preliminary screening， accounting for 1.27% of the total materials. Nine materials over mediately resistant were obtained via secondary screening， accounting for 0.82% of the total materials. Besides， three of them（RL6，RL9 and RL14） were resistant to a number of bacterial leaf streaks at three growth stages. In particular， RL6 presented broad-spectrum resistance to multi-strains with high resistance levels. Six of them（RL2、RL4、RL5、RL8、RL11 and RL12） were resistant to single strain at single growth period. 【Conclusion】The obtained three materials are broad-spectrum resistant to rice bacterial leaf streak at multiple growth periods， which can be served as an important source for cultivating disease-resistant rice varieties. RL6 maintains high broad-spectrum resistance at all growth stages， which can be used as a prior resistance source for breeding rice varieties. While the six materials obtained with resistance at particular growth stages can be used as alternative resistance sources.

Key words： rice； bacterial leaf streak； broad-spectrum resistance； resistant resource

0 引言

【研究意義】水稻细菌性条斑病（简称细条病）是由Xanthomans oryzae pv. oryzicola引起、广泛分布在亚热带地区的细菌性水稻病害，能导致水稻减产15%～20%，严重时可减产40%以上（陈玉奇等，1990）。目前生产上的水稻主栽品种普遍对细条病缺乏抗性，且随着种质资源交流的日益频繁，水稻细条病在我国传播越来越广，已成为制约我国水稻产量的重要因素。抗性品种的选育与推广是目前控制水稻细条病最有效的方法，而抗源的筛选与有效利用是抗性品种培育的关键。已有研究表明大多数细条病菌菌株与水稻品种之间表现为弱互作关系，就单个菌株而言，对水稻苗期和成株期的致病力分化表现并不一致（张荣胜等，2011）。即使在同一生育期，同一水稻品种对不同菌株所表现的抗性也不相同（郭亚辉和许志刚，2006），这使得通过单一生育期单菌株的抗性筛选方式得到的抗源极易在实际使用中失去抗性而造成损失。因此，只有筛选出在多个生育期具有广谱抗性的抗源，对水稻细条病的抗性品种培育才能起到较大的作用。【前人研究进展】目前已有研究证实在水稻种质中存在部分对细条病具有一定抗性的材料。张晓葵等（1992）对2551份水稻材料进行了抗细条病鉴定，得到高抗材料3份、较抗病材料538份；李友荣等（1994）鉴定了5024份水稻材料对细条病的抗性，结果发现有1.0%的材料属于抗性材料，3.5%属于中抗材料；王汉荣等（1995）鉴定了3343份水稻材料对细条病的抗性，结果发现有5.77%的材料属于抗性材料，15.55%属于中抗材料。在野生稻资源中存在更高比例的抗性资源，如岑贞陆等（2007）从977份广西野生稻材料中筛选获得37份中抗细条病材料；黄大辉等（2008）从31份药用野生稻材料中筛选获得15份抗细条病材料。【本研究切入点】前人研究获得的水稻细条病抗性资源均是在材料的单一生育期对某一菌株进行抗性鉴定获得，不具有多生育期的广谱抗性，在实际应用中存在缺陷和局限性。至今尚未见水稻细条病广谱抗源发掘的相关报道。【拟解决的关键问题】通过对遗传背景丰富的水稻种质资源进行多生育期、多强致病细条病菌菌株重复接种进行抗性筛选，以期获得在多个生育期对细条病具有稳定抗性的水稻广谱抗源，为水稻细条病抗性品种的培育提供可靠的抗源材料。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试水稻品系材料共1100份，包括籼稻品系400份、粳稻品系50份、籼粳杂交后代品系200份、普通野生稻与籼稻杂交后代品系400份、普通野生稻与粳稻杂交后代品系50份，具有较丰富的遗传多样性；以通用感病品种金刚30为感病对照；供试材料均由亚热带农业资源保护与利用国家重点实验室野生稻资源保护与利用课题组提供。供试的强致病力水稻细条病菌菌株共5株（WR1、WR2、WR3、WR4和WR5），由亚热带农业资源保护与利用国家重点实验室何勇强教授提供，5株菌株分别分离自广西玉林、百色、河池、博白和南宁等地，具有地区代表性。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 材料种植 初筛材料种植：1100份水稻材料浸种催芽后播种，4叶期时移植于有隔离栏的种植池内，每份材料种植5株；感病对照金刚30种植2行10株。复筛材料种植：将初筛获得的抗性材料分为3份，间隔20 d进行播种，4叶期时移植于有隔离栏的种植池内，每份材料种植5行，每行5株；感病对照金刚30种植2行10株。试验均设3次重复，按常规进行田间管理。

1. 2. 2 菌液配制 将供试细条病菌菌种分别在NA培养基上活化48 h，挑取单菌落接种于200 mL NB培养基上，28 ℃下200 r/min摇床培养至对数期，6000 r/min离心10 min后去上清液，用灭菌水配成悬浊液，再稀释至3×10 8 CFU/mL用于接种，现配现用。将5个配制好的等浓度强致病性菌液等比例混合即为混合接种菌液。

1. 2. 3 抗性鉴定方法 参照谢关林（1991）的方法采用针刺法接种进行抗性鉴定。将2枚灭菌大头针固定于橡皮块上，2针间距0.8 cm，滅菌备用。在培养皿中放置直径9 cm、厚2 cm的吸水海绵，海绵吸饱菌液后，将距叶尖15 cm处的叶片放置于海绵碟上，用橡皮上的2枚大头针隔叶脉刺下，使橡皮挤压海绵，保证针刺伤口接触到菌液。接种过程中根据需要适当补充海绵碟中的菌液。接种完毕后盖膜保湿24 h。

初筛仅在成株期进行抗性鉴定，每份材料以混合菌液接种5株，每株接种3片健康叶片，接种15 d后待感病对照金刚30充分发病时调查针孔处病斑长度，以每个材料的病斑平均长度划分抗性级别。复筛在苗期、分蘖初期、成株期3个时期进行，3期材料分期播种，同时进行接种处理；接种时采用分菌株接种，每份材料每个菌株每处理接种5株，每株接种3片健康叶片，接种15 d后待感病对照金刚30充分发病时调查针孔处病斑长度，以3次试验重复的病斑平均长度划分抗性级别。

1. 2. 4 抗性级别划分 参考农秀美等（1994）的方法，依照病斑长度划分抗性级别（表1）。同时，判定病斑长度小于1.5 cm为抗性反应（0、1、3、5级），病斑长度大于或等于1.5 cm为感性反应（7、9级）。

2 结果与分析

2. 1 初筛结果

对1100份水稻品系材料使用强致病力细条病混合菌株进行接种筛选，结果（表2）显示，在1100份材料中有抗病材料（1～5级）14份，仅占全部材料的1.27%，感病材料（7～9级）1086份，占98.73%。初筛未发现对细条病免疫的材料，对细条病表现高抗、抗和中抗的材料分别有2、6和6份。

2. 2 复筛结果

为了获得抗性稳定的抗源，进一步对初筛结果中的抗性材料在苗期、分蘖初期和成株期分别用5株强致病性水稻细条病菌菌株进行重复接种鉴定。

2. 2. 1 各材料对各病原菌的抗性反应 将初筛获得的14份抗性材料分别命名为RL1～RL14，复种鉴定结果（表3）显示，有9份材料（RL2、RL4、RL5、RL6、RL8、RL9、RL11、RL12和RL14）至少在一个生育期对1株菌株表现出抗性反应，有5份材料（RL1、RL3、RL7、RL10和RL13，表3中未列出）在全生育期对5株菌株均表现为感性反应。

2. 2. 2 抗性材料在各生育期的抗性 由表4可知，大部分抗性材料只在单个生育期对某一菌株表现出抗性，如RL2只在苗期对WR5表现抗性，RL5只在苗期对WR1表现抗性，RL4、RL8、RL11和RL12只在成株期对WR4表现抗性。小部分抗性材料即使在多个生育期表现抗性，但在不同菌株间表现不同：RL14对WR1在苗期和分蘖初期表现抗性，对WR4在苗期和成株期表现抗性，对WR5则在分蘖初期和成株期表现抗性，对WR2和WR3只在苗期表现出抗性；RL9对WR4和WR5能保持全生育期抗性，对WR3则在苗期和分蘖初期2个生育期表现出抗性，对WR1和WR2都只在分蘖初期具有抗性。RL6在全生育期对5个菌株均保持抗性。

2. 2. 3 抗性材料的抗谱 由表5可知，大部分抗性材料仅具有窄谱抗性：RL2、RL4、RL5、RL8、RL11和RL12均在某个生育期只对1株菌株具有抗性；3份材料在某些生育期具有广谱抗性：RL14在苗期对4株菌株具有抗性；RL9在分蘖初期对5株菌株均具有抗性，苗期和分蘖初期对3株菌株同时保持抗性，而在全生育期对2株菌株保持抗性；RL6在全生育期对5株菌株均具有抗性。

2. 2. 4 优良抗性材料的抗性表现 抗性材料RL6、RL9和RL14均在多个生育期具有广谱抗性（表4、表5和表6）。进一步分析3份优秀抗性材料的抗性级别，RL6在3个生育期对5株致病菌株主要表现为高抗级（HR级）和抗级（R级）；RL9对5株致病菌株的抗性主要为抗级（R级）和中抗级（MR级）；RL14在苗期的广谱抗性主要为抗级（R级），分蘖初期和成株期对各菌株的抗性则以中抗级（MR级）为主（表6）。

3 讨论

本研究对1100份水稻品系进行抗水稻细条病筛选，初筛结果显示有14份材料表现出抗性反应，再通过复筛确定了9份抗性稳定的材料，其中有1份材料（RL6）在3个生育期表现出对多菌株的广谱抗性，且抗性水平高，抗性级别达HR和R级，表明这份广谱抗性材料具有重要的应用价值，另外2份抗性材料（RL9和RL14）虽然抗性略弱于RL6，但仍在多个生育期具有广谱抗性，且对部分菌株具有较高抗性。在目前水稻育种严重缺乏多生育期广谱抗细条病抗源的情况下，本研究发现的这3份广谱抗源可为水稻育种和基因挖掘提供理想材料。

为减少工作量和提高效率，本研究初筛时每份材料重复较少。一部分在初筛中表现出抗性的材料在复筛时不具有抗性，表明水稻对细条病的抗性稳定性差，易受环境影响，特别是由于细条病菌对水稻的侵染受温度、湿度、宿主生理状况等环境因素影响较大（年少良，2009），导致抗性筛选的准确性降低。因此，进行多环境条件下重复筛选，才能获得稳定的抗性资源。另一方面，目前国际上对水稻细条病的致病机理研究或抗源筛选绝大部分均基于其在分蘖期或成株期对某一个菌种抗性鉴定的基础上进行（戴良英和陈贞，1988；张晓葵等，1992；农秀美等，1994；岑贞陆等，2007；黄大辉等，2008；贺文爱等，2010），针对多个生育期多菌株的抗性变化研究较少。已有研究表明大多数细条病菌菌株与水稻品种之间表现为弱互作关系，就单个菌株而言，对苗期和成株期的致病力分化并不一致（郭亚辉和许智刚，2006），本研究结果也能反应出相同的信息。某一生育期的鉴定结果无法代表其他生育期的抗性情况，即使是同一生育期，同一水稻品种对不同的细条病菌菌株也可能表现出完全不同的抗性能力。在水稻细条病抗性品种选育上，若对抗源仅进行单个生育期、单个菌种的筛选，则很可能最终培育出的品种在其他生育期对细条病菌表现为感，或对其他细条病菌菌株表现为感，降低了品种的实用价值。因此，在水稻细条病抗性品种选育过程中，对抗源的筛选宜进行多生育期多菌株的抗性鉴定，才能获得抗性稳定可靠的广谱性抗源。本研究从1100份水稻材料中仅获得3份广谱抗源材料（0.27%），表明在水稻种质中对水稻细条病具有广谱高抗的材料非常缺乏，进一步对水稻资源进行多生育期多菌株筛选，获得更多广谱抗源仍是抗细条病品种育种的重要途径。

已有研究认为，水稻對细条病菌的抗性是由一系列QTL相互作用的结果（Khush，1977；夏怡厚等，1992； Tang et al.，2000；Chen et al.，2006），正好解释了水稻在不同生育期抗性变化无明显规律，且对不同菌种表现不同抗性的原因，因而在细条病抗性品种选育过程中对抗性基因/QTL的聚合显得尤为重要。但同一抗性基因，在不同的遗传背景下发挥的抗性能力也可能不一致（Hammond-Kosack et al.，1994；Dixon et al.，2000）。因此，只有在具有丰富遗传背景的材料中进行筛选，才有可能发掘出抗性更强的水稻材料。

4 结论

本研究通过初筛及多生育期多菌株复筛，获得9份对细条病具有一定抗性的水稻材料，其中有3份材料（RL6、RL9和RL14）在水稻3个生育期均对多株水稻细条病菌菌株具有抗性，可作为重要的水稻抗源应用于水稻抗细条病品种培育，其中RL6在各生育期均保持较高的广谱抗性，可作为优质抗源优先应用于水稻抗性品种培育；另有6份材料（RL2、RL4、RL5、RL8、RL11和RL12）在单株水稻细条病菌生育期对单株水稻细条病菌菌株具有抗性，可作为抗性品种培育的候选材料。

致谢：本研究所用细菌性条斑病菌株由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的何勇强教授提供，特此感谢！

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（責任编辑 麻小燕）