安徽凤阳玉米穗腐病病原菌的分离鉴定

许大凤 张海珊 李廷春

摘要 [目的]明确凤阳玉米穗腐病的病原菌种类。[方法]在凤阳玉米种植区采集玉米穗腐病样品，采用组织分离法对病样进行分离与纯化，结合病原菌形态学特征与分子生物学进行鉴定。[结果]分离得到的56株病原菌分别为禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、串珠镰孢菌（Fusarium verticillioides）、多变根毛霉（Rhizomucor variabilis）和青霉菌（Penicillium spp.），其分离频率分别为44.64%、21.42%、14.29%、14.29%和5.36%。禾谷镰孢菌Fg21菌丝生长温度为5～30 ℃，最适生长温度为25 ℃，最适pH为7.0；尖孢镰孢菌Fa09菌丝生长温度为10～35 ℃，最适生长温度为28 ℃，最适pH为7.0；串珠镰孢菌Fv03菌丝生长温度为10～35 ℃，最适生长温度为25 ℃，最适pH为10.0；碳源对镰孢菌菌株营养生长影响相对稳定，而氮源对其营养生长影响的变幅较大。[结论]试验结果为玉米穗腐病的综合防治提供了理论依据。

关键词 玉米穗腐病；病原鉴定；生物学特性

中图分类号 S435.131 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）25-0145-04

Abstract [Objective] The aim was to know the pathogens causing maize ear rot in Fengyang.[Method] The maize ear rot samples were collected from Fengyang County.The tissue isolation method was adopted to isolate the maize disease samples，and then purified them.The pathogens were identified based on results of morphological characteristics and molecular biology.[Result] Fiftysix isolates were identified as members of Fusarium gra minearum，Fusarium oxysporum，Fusarium verticillioide，Rhizomucor variabilis and Penicillium spp.，and the isolation frequency were 44.64%，21.42%，14.29%，14.29% and 5.36%，respectively.In this experiment，Fusarium gra minearum was the predo minant species in maize ear rot.The Fusarium gra minearum Fg21 could grow under 5-30 ℃，with optimal condition at 25 ℃，pH 7.0；the Fusarium oxysporum Fa09 could grow unde 10-35 ℃，with optimal condition at 28 ℃，pH 7.0；the Fusarium verticillioide Fv03 could grow unde 10-35 ℃，with optimal condition at 25 ℃，pH 10.0.Vegetative growth of Fg21，Fa09 and Fv03 were found to be significantly influenced by nitrogen source compared with carbon source.[Conclusion] The results provide theoretical basis for comprehensive prevention and control of maize ear rot.

Key words Maize ear rot；Isolation of pathogenic bacteria；Biological characteristics

玉米穗腐病是一種世界性的玉米病害，不仅造成产量损失严重，而且严重影响玉米的品质[1]。侵染玉米穗腐病病原菌种类较多，达30余种[2]，镰孢菌约有15种[3-4]。国外报道常见镰孢菌主要有胶孢镰孢、轮枝镰孢（F.verticilliods）、禾谷镰孢（F.graminearum）、层出镰孢（F.proliferatum）、木贼镰孢菌（F.equiseti）等[5-8]，而国内报道有串珠镰孢菌（F.moniliforme）、禾谷镰孢菌、黄色镰孢菌、尖镰孢菌（F.oxysporum）、木贼镰孢菌、亚粘团镰孢菌和层出镰孢菌等[9]。由于该病是由几种甚至十几种病原菌复合侵染引起的，因而较难防治；同时穗腐病发病期在穗期，则更加大了防治难度；抗病品种是防治玉米穗腐病最有效的措施。因此，鉴定出病原菌并测出优势病原菌，是进行品种资源抗病性鉴定的首要问题。

笔者对安徽凤阳玉米穗腐病进行调查和取样，采用形态学观察和分子生物学鉴定的方法对玉米穗腐病病样品进行了分离鉴定，并对其进行了生物学特性研究，旨在为玉米穗腐病的综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

根据田间自然发病植株，于2015年7月至2016年9月从安徽省凤阳县共采集病穗26份，将其分别装入信封袋中，标记，带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离。选取病穗病健交界处3～5粒玉米粒，2%次氯酸钠表面消毒5 min，无菌水洗涤3次后放入PDA平板培养基上，28 ℃下培养4 d，选取不同菌落进行形态学鉴定纯化培养。

1.2.2 病原菌的鉴定。

1.2.2.1 形态学鉴定。

参照《真菌鉴定手册》[10]《常见镰刀菌鉴定指南》[11]和《植病研究方法》[12]对分离的病原菌进行形态学鉴定。通过观察菌株的形态特征及培养性状进行病原菌的鉴定。将分离的菌株在PDA培养基上进行培养，观察菌落形态及颜色等性状。采用SNA培养基对分离菌株进行培养，对病原菌进行观察[11，13-14]。

1.2.2.2 分子生物学鉴定[15-16]。

将分离纯化的分离物接种于表面贴有灭菌玻璃纸的PDA平板上，28 ℃培养5 d，挑取菌丝，加入30 μL 0.5 mol/L NaOH，用灭菌的研磨棒充分研磨，然后加水至1 500 μL（含量少的加水至1 000 μL），摇匀，12 000 r/min离心5 min，取上清做模板。

选用真菌rDNA-ITS区域通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），进行PCR扩增。PCR反应体系： Pre.mix.Taq 25 μL，引物ITS1和ITS4各1 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O 补足至50 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海英潍捷基公司测序，将测序结果在GenBank 数据库中进行比对。

1.2.3 生物特性的研究。

1.2.3.1 温度对病原菌营养生长的影响。

将病原菌菌株在PDA平板上28 ℃下培养3 d，用灭菌的内径为6 mm的打孔器切取菌落边缘菌饼，移至PDA平板上中央，分别于5、10、15、20、28、25、30和35 ℃共8个温度下黑暗培养3 d，每处理3个重复。3 d后用十字交叉法测量菌落生长直径。

1.2.3.2 pH对病原菌营养生长的影响。

用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl将灭过菌的PDA培养基调节pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0共8个梯度。移植6 mm的菌饼于PDA平板的中央，28 ℃下黑暗培养3 d，每个处理3个重复。3 d后用十字交叉法测量菌落生长直径。

1.2.3.3 病原菌对碳、氮的利用。

将病原菌菌株在PDA平板上28 ℃下培养3 d，用灭菌的内径为6 mm的打孔器切取菌落边缘菌饼，分别移至葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、甘露醇和可溶性淀粉做成的不同碳源固体培养基中央；DL-天门冬酰胺、牛肉膏、酵母膏、硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨和尿素做成的不同氮源的固体培养基中央，28 ℃黑暗条件下培养3 d，每个处理3个重复。3 d后用十字交叉法测量菌落生长直径。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

对采集的26个玉米穗腐病穗进行分离、纯化后，共获得菌株56个，通过形态学和分子生物学鉴定得到3种镰孢菌，分别为禾谷镰孢（F.graminearum）、尖孢镰孢（F.axysporum）和串珠镰孢（F.verticillioides），以及多变根毛霉（Rhizomucor variabilis）和青霉菌（Penicillium spp.）。

根据病原菌分离物形态特征及在PDA和SNA平板培养基中的菌落形态等培养特征进行观察（图1），禾谷镰孢菌在PDA培养基上菌丝紫色絮状，菌落紫红色，大型分生孢子比较长，顶部细胞渐尖。尖孢镰孢菌在PDA培养基上菌丝白色绒毛状，菌落粉白色，略带有紫色；小型分生孢子数量较多，椭圆形，多无分隔；厚垣孢子呈球形，顶生。串珠镰孢菌在PDA培养基上菌丝白色、棉絮状，基部为浅粉色。小型分生孢子瓜子形，多串生，无分隔。在形态学鉴定过程中未观察到大型分生孢子，且无厚垣孢子产生（图2）。

2.2 分子生物學鉴定

经初步形态学鉴定，选取代表菌株，提取基因组DNA后，用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，得到500 bp左右的目的片段，将扩增后的产物送往上海英潍捷基公司测序，将测序结果（图3）在GenBank 数据库中比对，得出结果和形态学鉴定结果一致。

2.3 分离频率

通过对凤阳穗腐病的分离、鉴定，得到禾谷镰孢菌25株，为安徽凤阳地区的优势病原菌，分离频率为44.64%；尖孢镰孢菌12株，分离频率为21.42%；串珠镰孢菌及多变根毛霉各8株，分离频率为14.29%；青霉菌3株，分离频率为5.36%。禾谷镰孢菌为安徽省凤阳县玉米穗腐病病原菌的重要组成部分，应作为凤阳县玉米穗腐病的重点防治对象。

2.4 玉米穗腐病主要病原菌的生物学特性

2.4.1 温度对病原菌营养生长的影响。

玉米穗腐病病原菌不同，对温度的适应范围也有所不同，总体来说，病原菌对温度有较宽的适应范围（图4）。禾谷镰孢菌Fg21菌丝在5～30 ℃均可生长，菌落平均直径为2～65 mm。不同温度下，菌落扩展速度不同，其中适宜温度为20～28 ℃时菌落平均直径为44～65 mm，最适宜温度为25 ℃时菌落平均直径为65 mm。高于30 ℃时生长速率减慢，菌落平均直径为21 mm，35 ℃时菌丝停止生长。

串珠镰孢菌Fv03菌丝在10～35 ℃均可生长，菌落平均直径为9～38 mm。不同温度下，菌落扩展速度不同，其中适宜温度为25～28 ℃时菌落平均直径为35～38 mm，最适宜温度为25 ℃时菌落平均直径为38 mm。5 ℃下菌丝停止生长，高于35 ℃生长速率减慢，菌落平均直径为3 mm。

尖孢镰孢菌Fa09菌丝在10～35 ℃均可生长，菌落平均直径为5～44 mm。不同温度下，菌落扩展速度不同，其中适宜温度为25～30 ℃时菌落平均直径为32～44 mm，最适宜温度为28 ℃时菌落平均直径为44 mm。5 ℃下菌丝停止生长，高于35 ℃时生长速率减慢，菌落平均直径为10 mm。

2.4.2 pH对玉米穗腐病主要病原菌营养生长的影响。

pH为3.0时，PDA平板不能凝固，玉米穗腐病病原菌对酸碱度适应范围很广，pH在4.0～10.0时均可生长。禾谷镰孢菌Fg21在pH 4.0～7.0时生长较快，菌落平均直径为22～38 mm，pH高于7.0时，菌丝生长速度开始下降，最适合菌落扩展的pH为7.0；串珠镰孢菌Fv03随着pH的升高，菌丝生长速度逐渐增长，pH为10.0时，菌落直径达到最大，为39 mm；尖孢镰孢菌Fa09在pH为4.0～7.0时生长较快，菌落平均直径为33～46 mm，pH高于7.0时，菌丝生长速度开始减慢，但pH为8.0～10.0时菌丝生长速度一致，菌落直径一直稳定在43 mm，最适合菌落扩展的pH为7.0（图5）。

2.4.3 玉米穗腐病主要病原菌对碳、氮源的利用。

玉米穗腐病病原菌都能利用多种碳源和氮源，在供试碳源和氮源中28 ℃下培养3 d均能生长。禾谷镰孢菌Fg21生长较好的碳源为乳糖和可溶性淀粉，其次是甘露醇，菌落平均直径≥32 mm；生长较差的碳源为果糖，菌落平均直径为20 mm。串珠镰孢菌Fv03在碳源中生长较好，菌落平均直径在39～43 mm，其中在蔗糖和甘露醇中生长最好，菌落平均直径为43 mm。尖孢镰孢菌Fa09生长较好的碳源为麦芽糖，菌落平均直径为40 mm；生长较差的碳源为葡萄糖，菌落平均直径为29 mm（图6）。

禾谷镰孢菌Fg21生长较好的氮源为酵母膏，菌落平均直径为43 mm；在硫酸铵和尿素中生长较差，菌落平均直径为15～16 mm。 串珠镰孢菌Fv03生长较好的氮源为蛋白胨，菌落平均直径为44 mm；其次是酵母膏、硝酸鉀，菌落平均直径为42 mm；生长较差的氮源为尿素，菌落平均直径为16 mm。尖孢镰孢菌Fa09生长较好的氮源为蛋白胨，菌落平均直径为41 mm；其次是牛肉膏、酵母膏，菌落平均直径为40 mm；生长较差的氮源为尿素，菌落平均直径为15 mm（图7）。由此可见，3种病原菌对氮源尿素的利用较差，尿素不利于3种镰孢菌的生长。

3 结论与讨论

该研究在安徽凤阳玉米育种基地的发病玉米穗上分离到56株病原菌，通过鉴定得出：禾谷镰孢菌25株，分离频率为44.64%；尖孢镰孢菌12株，分离频率为21.42%；串珠镰孢菌和多变根毛霉各8株，分离频率为14.29%；青霉菌3株，分离频率为5.36%。

由于引起玉米穗腐病原菌种类较多，各国各地报道的优势种类也各不相同。国外报道，禾谷镰孢菌（F .graminearum）和赤霉菌（Gibberella zeae）是玉米穗腐病的优势种[17-18]，我国学者有的认为串珠镰孢菌（F.moniliforme）为优势菌株[19-22]，有的认为轮枝镰孢为优势病原菌[19，23-26]；该试验对安徽凤阳地区玉米穗腐进行了详细的分离和鉴定，结果显示禾谷镰孢菌为凤阳玉米穗腐病病原的主要病原菌，这与以上学者的报道有所不同，但与李顺德等[27]的报道一致。由此可以看出，我国玉米产区不同，穗腐病致病镰刀菌的优势种群存在差异，这可能与各地区的栽培品种、栽培制度及气候环境条件等不同有关。

从镰孢菌的生物特性研究可以看出，禾谷镰孢菌Fg21菌丝最适生长温度为25 ℃，0～35 ℃存在最高温度，5 ℃时该病菌可以缓慢生长，最适pH为7.0，最佳碳源是乳糖和可溶性淀粉，最佳氮源是酵母膏；串珠镰孢菌Fv03和尖孢镰孢菌Fa09在10～35 ℃均可生长，25 ℃是串珠镰孢菌Fv03菌丝最适生长温度， 随着pH的升高，菌丝的生长越快，pH为10.0时菌落直径达到最大，其最佳碳源是蔗糖和甘露醇，最佳氮源是蛋白胨；尖孢镰孢菌Fa09最适生长温度为28 ℃，最适pH为7.0，其最佳碳源是麦芽糖，最佳氮源是酵母膏。碳源对镰孢菌营养生长影响相对稳定，而氮源对镰孢菌营养生长影响的变幅较大。

通过对安徽凤阳玉米穗腐病的研究，明确了禾谷镰刀菌为凤阳玉米穗腐病的优势病原菌，这有利于摸清凤阳地区玉米穗腐病的发生规律及其致病机理，从而更好地用于指导穗腐病的防治，为穗腐病抗病育种提供参考。

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