不同方法提取苦荞蛋白的体外抗氧化活性研究

何晓兰 雷霆雯 许庆忠

摘要 [目的]研究不同方法提取苦荞蛋白的体外抗氧化活性。[方法]以贵州威宁种植的苦荞为材料，通过蛋白质含量测定、清除羟基自由基能力测定对碱溶酸沉法提取苦荞粗蛋白和Osborne法分级提取苦荞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白进行了比较分析。[结果]通过碱溶酸沉法提取能获得大量的可溶性蛋白，Osborne法提取的蛋白虽然含量较低但获得的种类较多；各种蛋白均具有清除羥基自由基的能力，其清除羟基自由基能力从大到小依次为清蛋白、碱溶酸沉法提取的粗蛋白、谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。[结论]碱溶酸沉法和Osborne法提取的苦荞蛋白均具有体外抗氧化能力。

关键词 苦荞蛋白；碱溶酸沉法；Osborne法；抗氧化活性

中图分类号 TS201.2+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）25-0134-02

Abstract [Objective] The research aimed to study the antioxidant activity in vitro of tartary buckwheat proteins by different methods. [Method]Tartary buckwheat proteins was prepared by alkalisolution and acidisolation， and albumin， globulin， prolamin and glutelin from tartary buckwheat were obtained by different solubility extraction. The coomassie brilliant blue protein quantitative was used in determination of protein concent and chemical colorimetric method was used to determinate the ability to remove hydroxyl radicals（·OH） of each protein fraction.[Result]The results showed that proteins obtained by alkalisolution and acidisolation methos were the predominant fraction. Proteins extracted by different methods had the ability to remove hydroxyl radicals， and the order of radical scavenging activity was albumin， proteins obtained by alkalisolution and acidisolation methods， glutelin， globulin and prolamin.[Conclusion]Both the alkalisoluble acid precipitation method and the Osborne method have the antioxidant capacity of tartary buckwheat protein.

Key words Tartary buckwheat proteins；Alkalisolution and acidisolation method；Osborne method；Antioxidant activity

苦荞，又名鞑靼荞麦，属于蓼科荞麦属。我国苦荞种植面积和产量均居世界第一位[1]，主要生长在我国的西南山区。《神龙书》中将苦荞认为是“五谷杂粮之王也”，说明苦荞是一种举足轻重的功能性食品，其营养价值和药用价值均较高。

已有文献报道，苦荞蛋白具有降低血浆胆固醇、改善便秘、抑制脂肪蓄积和预防肿瘤的作用[2]，这可能与苦荞蛋白的低消化率有关[3]。苦荞蛋白质的氨基酸组成比较均衡，具有较高的生物价值[4]。苦荞蛋白富含人体限制性氨基酸（赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸），精氨酸的含量也较高，与小麦相比，苦荞蛋白中谷氨酸和脯氨酸的含量低[5]。有研究报道苦荞蛋白的低消化率、赖氨酸和精氨酸的比例以及蛋氨酸和甘氨酸的比例是苦荞蛋白具有降低血浆胆固醇作用的关键因素[6]。同时，苦荞蛋白还富含硫胺素结合蛋白，可以作为维生素B1的补充剂[7]。

目前，分离植物种子蛋白的方法主要有碱溶酸沉法、乙醇提取法、膜分离法、酶解酸沉法、离子交换法和Osborne法等[8]。其中，碱溶酸沉法是利用弱碱性水溶液浸泡脱脂苦荞粉，将其中的可溶性蛋白质萃取出来，然后用一定量的盐酸水溶液加入已溶解出的蛋白质液中，调节其pH到苦荞蛋白的等电点，使大部分蛋白质沉淀下来得到苦荞分离蛋白产品。该法操作方便、无需加热、节约能源、成本低、沉淀快、可减少生物碱含量，并可破坏多种不利因子，如某些酶类、植物雌激素和皂素等[9]。Osborne分离法的原理是根据各种蛋白质在不同溶剂中溶解度不同的性质，利用最简单的溶液/沉淀分离手段将可溶性蛋白与不溶性蛋白进行分离；尽管该方法发明已经有100多年历史，尚有改进的余地，而且蛋白质的总回收率也不高，但是可以将清蛋白（Albumin）、球蛋白（Globulin）、醇溶蛋白（Prolamin）和谷蛋白（Glutelin）4种组分逐一分离开来。笔者分别采用了碱溶酸沉法和Osborne法提取苦荞蛋白，并比较各分离蛋白的体外清除羟基自由基能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。苦荞粉，购自贵州威宁苦荞专卖店。

1.1.2 主要试剂。NaOH、NaCl，成都市联合化工试剂研究所；羟基自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子测试盒，南京建成生物工程研究所；Bradford蛋白质定量试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器。DF-II数显集热式磁力搅拌器，金坛市杰瑞尔电器有限公司；三用电热恒温水箱，天津市泰斯特仪器有限公司；电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；PHS-3C实验室PH计，上海鹏顺科学仪器有限公司；超速冷冻离心机3K30，德国SIGMA；AP-01P真空泵，天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1

碱溶酸沉法提取苦荞粗蛋白。苦荞粉用石油醚浸泡24 h脱脂后抽干，再用三氯甲烷浸泡8 h脱去生物碱，抽干后将已脱脂脱生物碱的苦荞粉按1∶10的比例加入ddH2O，用1 mol/L的NaOH调节pH至8.0后置于磁力搅拌器内搅拌2 h，4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，离心后取上清用1 mol/L的HCl调节pH至4.5接近苦荞粗蛋白的等电点，以利于苦荞蛋白沉淀，蛋白沉淀用ddH2O冲洗2次后用0.1 mol/L的NaOH调至中性，置于-20 ℃冰箱冻存24 h，再将冻结的蛋白置于冷冻抽干机抽去水分，由此制得苦荞粗蛋白粉末。该粉末置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2

Osborne法分级提取苦荞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。苦荞粉用石油醚浸泡24 h脱脂后抽干，再用三氯甲烷浸泡8 h脱去生物碱，抽干后将已脱脂脱生物碱的苦荞粉按1∶10的比例加入ddH2O，置于磁力搅拌器内室温搅拌1 h，4 ℃ 4 000 r/min离心30 min，将上清与沉淀分离，上清中含有清蛋白，将上清置于-20 ℃冰箱冻存，沉淀加入10倍体积2%的NaCl，置于磁力搅拌器内室温搅拌1 h，4 ℃ 4 000 r/min 离心30 min，再次将上清与沉淀分离，上清中含有球蛋白，上清置于-20 ℃冰箱冻存，沉淀加入10倍体积70%的乙醇，重复上述步骤得到醇溶蛋白；继续向所得沉淀物中加入10倍体积0.005 mol/L的NaOH，再次重复上述提取步骤，得到谷蛋白。最后弃掉沉淀，将所分离提取的4种蛋白置于透析袋中，用去离子水于4 ℃下透析48 h后，冻置于冷冻抽干机抽去水分，由此制得苦荞清蛋白、苦荞球蛋白、苦荞醇溶蛋白、苦荞谷蛋白粉末。蛋白粉末置于-20 ℃冰箱长期保存。

1.2.3

苦荞蛋白定量。

1.2.3.1

标准曲线的制备。取0、10、20、30、40、50、60 μL牛血清白蛋白（BSA）标准溶液（1 mg/mL）分别加入到试管中，加入PBS补足至150 μL，向各试管中加入2.85 mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置10 min，在595 nm波长处测定吸光度。以蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。

1.2.3.2

蛋白含量的测定。将称量好的苦荞蛋白溶于一定体积的双蒸水，充分混匀后制得样品液。取50 μL样品液于干净试管中，然后用PBS补足到150 μL，再加入考马斯亮蓝染液2.85 mL，混匀，室温静置10 min，于波长595 nm 处比色，读取吸光值，由标准曲线即可求出样品液的蛋白含量。

1.2.4

苦荞蛋白各组分冻干粉清除羟基自由基活性测定。按照羟基自由基测定试剂盒说明书进行操作，即先选取合适的取样浓度，以抑制率在20%～50%为最佳取样浓度。设置好取样浓度后根据下列公式计算出各蛋白组分抑制羟基自由基能力（U/mg）。

抑制羟基自由基能力=对照吸光度-测定管吸光度标准吸光度-空白管吸光度×标准管浓度蛋白毫克数×取样量

1.3 统计分析 采用SPSS 24.0统计软件进行统计分析。所有试验均重复3次，试验数据用平均数±标准差（±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 苦荞粗蛋白、清蛋白 、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白含量测定

各组蛋白采用考马斯亮蓝显色法进行定量，根据线性回归方程Y=0.012 6X+0.019 0（R2 =0.996 3）计算出各组蛋白浓度，并计算各组蛋白与脱脂苦荞粉的比例。结果表明，由碱溶酸沉法提取的苦荞粗蛋白在脱脂苦蕎粉中含量最高，为82.05 mg/g；Osborne法提取的各分离蛋白中，清蛋白含量最高，为13.24 mg/g，醇溶蛋白含量最低，为2.96 mg/g。比较碱溶酸沉法和Osborne法提取的苦荞蛋白量发现，碱溶酸沉法可得到较多的苦荞蛋白，而Osborne法提取的苦荞蛋白量较低，总量为31.04 mg/g，但可以获得比较多的蛋白种类，便于对各种蛋白的功能特性进行分析。

2.2 苦荞蛋白冻干粉各组分清除羟基自由基活性

采用比色法分别测定碱溶酸沉法提取的苦荞粗蛋白、Osborne法分级提取的苦荞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白清除羟基自由基的能力。由于VC是一种重要的自由基清除剂，常用来衡量其他物质抗氧化活性的大小，故选用VC作为参照。结果表明（图1），各种方法提取的苦荞蛋白均具有抑制羟基自由基活性作用，且都随浓度的升高，抑制率升高，呈现一定的浓度依赖性，量效关系明显，符合二次曲线方程。经计算，各分离蛋白抑制羟基自由基活性的IC50（当抑制率为50%的样品浓度）为：碱溶酸沉法提取的苦荞粗蛋白的抑制率为0.433 9 g/L、清蛋白为0.058 5 g/L、球蛋白为0.753 1 g/L、醇溶蛋白为4.308 7 g/L、谷蛋白为0.482 5 g/L，VC的抑制率为0.114 7 g/L。

选取各分离蛋白清除羟基自由基抑制率在45%～55%的样品浓度进行抑制羟基自由基能力计算，结果发现，清除羟基自由基能力从大到小依次为清蛋白（352.192）、VC（311.952）、碱溶酸沉法提取的苦荞粗蛋白（52.639）、谷蛋白（47.586）、球蛋白（33.964）、醇溶蛋白（4.932）。

3 结论

该试验通过碱溶酸沉法和Osborne法提取出苦荞蛋白，经测定发现由碱溶酸沉法提取出的苦荞粗蛋白冻干粉蛋白含量最高，脱脂苦荞粉中含苦荞粗蛋白82.05 mg/g，Osborne法提取出的各蛋白冻干粉虽含量相对较低但蛋白种类多。几种蛋白组分均具有抑制羟基自由基的作用，清除羟基自由基能力从大到小依次为清蛋白、粗蛋白、谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。其中，清蛋白抑制羟基自由基的作用强于传统的自由基清除剂VC。

参考文献

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