红发夫酵母有机硒最佳转化条件的研究

徐洲 朱文优 魏琴

摘要[目的]优化红发夫酵母（Phaffia rhodozyma）有机硒转化条件。[方法]通过正交试验研究硒添加量、培养时间和装液量对红发夫酵母富硒的影响。[结果]红发夫酵母富硒的最适培养基为PDA培养基，亚硒酸钠的添加方式为分2次添加，在硒添加量20 mg/L、培养时间30 h、装液量80 mL/500 mL的条件下，红发夫酵母的生物量达10.62 g/L，有机硒转化率达63.2%。[结论]研究结果为红发夫酵母富硒的进一步研究提供了参考。

关键词 红发夫酵母；有机硒；转化添加；生物量

中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）27-0017-03

Abstract [Objective] The aim was to optimize the transformation conditions of organic selenium by Phaffia rhodozyma.[Method] The effect of selenium addition， culture time and liquid loading on selenium accumulation in Phaffia rhodozyma was studied by orthogonal experiment.[Result] The optimum medium for selenium enrichment was PDA medium， and the adding method was added in two times.Under the condition of selenium content at 20 mg/L and the liquid loading at 80 mL/500 mL incubating for 30 h， the biomass and transformation rate of organic selenium could reach 10.62 g/L and 63.2%， respectively.[Conclusion] The results can be regarded as the reference for further research on selenium enrichment in Phaffia rhodozyma.

Key words Phaffia rhodozyma；Organic selenium；Conversion conditions；Biomass

硒（Se）是人體必需的微量元素之一，能促进人体生长发育，增强抗病能力，具有抗衰老等诸多生理作用[1-2]。硒在自然界以无机硒和有机硒2种方式存在，无机硒一般是指硒酸钠和亚硒酸钠，而有机硒主要是硒通过生物转化与氨基酸结合而成。人体对于硒的补充主要来源是饮食，无机硒具有生理毒性且生物活性较低不能被直接摄入；有机硒通常与其他物质结合成络合态或者以还原态形式存在并可以与某些氨基酸结合，常见基本形式为硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸等[3]。有机硒无生理毒性，且具有易于被动物吸收、体内利用性高等特点而成为人们关注的焦点[4-5]。

无机硒可以通过动物、植物和酵母菌等微生物转化成有机硒。植物、动物对无机硒转化存在周期长、受自然条件的变化影响大等缺点，因此，研究者更多地关注微生物对无机硒的转化利用方面。研究表明，酵母菌中的红发夫酵母自身含有丰富的蛋白质、维生素、肝糖和抗氧化能力较强的虾青素等物质[6-7]。如果能够利用红发夫酵母将无机硒复集转化成有机硒，便可以将富硒的红发夫酵母作为一种安全、营养成分更为丰富的有机硒补充剂。

要利用红发夫酵母用于有机硒的转化，就需要研究红发夫酵母的最适培养和发酵条件。鉴于此，笔者首先通过单因素试验，研究了不同培养基、无机硒添加方式、硒添加量、培养时间和装液量对红发夫酵母有机硒转化的影响，同时以有机硒转化率为指标，进行了正交试验优化，以确定红发夫富硒酵母富硒的最优条件参数，为红发夫酵母富硒的进一步研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料 红发夫酵母由固态发酵资源利用四川省重点实验室提供。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂 20 g/L；酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）：酵母膏10 g/kg，蛋白胨20 g/kg，葡萄糖20 g/kg，琼脂粉20 g/kg；市售硫酸铵培养基；市售尿素培养基。主要试剂：葡萄糖、硫酸铵、酵母膏、三羟甲基氨基甲烷 （Tris）、亚硒酸钠、盐酸、亚硒酸、盐酸苯肼、氯化钾、变色酸等，均为分析纯。

主要仪器：LRH-250型生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、HZQ-QX型摇床（黑龙江哈尔滨东联电子技术有限公司）、T6新世纪型紫外分光光度计（北京普析通用有限责任公司）、TGL-16GB型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、DHG-9620A型干燥烘箱（上海恒科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化。

取红酵母菌种，按无菌要求制备PDA斜面，挑取一定量红发夫酵母菌种分别转接到斜面上，放入28 ℃的生化培养箱中，培养观察2～3 d，待菌种变红色菌落后置于4 ℃备用。

1.2.2 富硒酵母初筛。

分别制备PDA培养基、YPD培养基、硫酸铵培养基和尿素培养基，在各种培养基平板中加入较高浓度亚硒酸钠溶液，自然冷却，向平板中加入0.1 mL活化的菌悬液，涂抹均匀，置入28 ℃培养箱内培养，通过比较，挑选菌落数较多的培养基平板菌种备用。

1.2.3 富硒工艺优化。

1.2.3.1 不同培养时间的影响。装液量为100 mL/500 mL三角瓶，培养基初始pH 5.0，后置于28 ℃、150 r/min摇床上培养，培养过程中分别在8、16、24、32、40、48 h时采用紫外分光度计法，定时取样测OD值，并制出其标准曲线。

1.2.3.2 不同装液量的影响。500 mL三角瓶中分别装入60、80、100、120、150 mL优化后发酵培养基，接种量为10%，硒添加量为25 mg/L，pH中性，在28 ℃下培养30 h后测定有机硒的转化率。

1.2.3.3 不同硒浓度的影响。装液量为100 mL/500 mL，在三角瓶中添加亚硒酸钠溶液使其浓度分别为0、5、10、15、20、25、30 mg/L，接种量为10%，转速为150 r/min，在28 ℃摇床中进行发酵培养，定期测定红酵母生物量及细胞内硒含量。

1.2.3.4 不同硒添加方式的研究。接种量为10%，转速为150 r/min，分别采用一次性添加亚硒酸钠溶液到相应的浓度；2次添加亚硒酸钠溶液到相应浓度，即第1次添加50%硒溶液，24 h后再添加50%硒溶液，在28 ℃摇床中进行发酵培养，定期测定红酵母的生物量及细胞内硒含量。

1.2.3.5 正交试验优化。通过前期单因素试验，选取3种影响作用更大的影响因子，以红发夫酵母有机硒转化率的高低作为响应值，进行正交试验设计优化，确定其最佳富硒工艺条件，正交试验因素与水平见表1。

1.2.4 检测方法。

1.2.4.1 生物量的测定。将发酵液富硒酵母4 000 r/min离心15 min，将菌体用蒸馏水洗涤3次，50 ℃烘干至恒重后称重。计算方法参考文献[1]的方法。

1.2.4.2 总硒含量的测定。

总硒含量（μg/L）=生物量×硒含量

1.2.4.3 硒转化率的测定。

有机硒转化率=硒总含量/添加硒的浓度×100%

2 结果与分析

2.1 红发夫酵母富硒培养基的筛选

由图1可知，红发夫酵母在不同培养基上生长呈现一定的差异，红发夫酵母在YPD 培养基上生长的菌落总数最多，而在尿素培养基上生长的菌落总数最少，这是4种培养基的主要营养物质氮源和碳氮比（C/N）不尽相同，而氮是构成微生物蛋白质和促进酵母生长的重要成分，氮源的利用速度将直接影响酵母生长与代谢状况。YPD和PDA培养基属于天然培养基，氮源等营养成分充足、C/N比例适当，可以更加有效地促进红发夫酵母的生长[8]，而硫酸铵培养基和尿素培养基的C/N比例不够协调，所以含有的营养物质促红发夫酵母的生长能力偏弱。YPD和PDA培养基菌落总数相差不大，综合考虑选用PDA培养基作为红发夫酵母进一步培养的培养基。

2.2 不同培养时间对酵母的影响

由图2可知，红发夫酵母培养从8 h开始生长计时，随着培养时间的延长，菌体的吸光度也开始逐渐增加[9-10]。经筛选的红发夫酵母延迟期约10 h，从15 h左右开始进入对数生长期，而在35 h附近红发夫酵母的菌体总量达最大值，随后菌体增殖缓慢进而生长下降，因此，将红发夫酵母富硒的培养时间初步确定为35 h。

2.3 装液量对酵母富硒的影响

装液量主要影响菌体培养液的体积溶氧系数（KLA），装液量越大，溶氧系数越小，反之亦然。由图3可知，装液量越小，菌体培养液的溶氧量越高，红发夫酵母的生物量越大，然而较大的装液量能显著提高红发夫酵母对无机硒的转化，当装液量达100 mL/500 mL 时有机硒转化增加率变化微小，所以将其初选为红发夫酵母的装液量。

2.4 硒浓度对酵母富硒的影响

由图4可知，随着硒浓度增加，红发夫酵母的生物量和有机硒的转化率均呈现先增加后减少的趋势。当硒浓度≤20 mg/L时，红发夫酵母生物量逐渐增多，表明硒浓度在该范围内对红发夫酵母的生长有促进作用，所以红发夫酵母对有机硒的转化率逐渐上升；而当硒浓度≥20 mg/L时，随着硒浓度逐渐增加，红发夫酵母生物量降低速率加快，表明过量硒对红发夫酵母的生长有抑制作用，且硒浓度越大，对红发夫酵母生长的抑制作用越明显，同时导致红发夫酵母对有机硒的转化率降低明显，因此，选择20 mg/L作为硒添加浓度。

2.5 不同添加方式对酵母富硒的影响

由图5可知，当培养基中硒浓度≥15 mg/L时，2次添加方式对有机硒的转化率明显高于1次添加的方式。1次添加方式红发夫酵母对有机硒的转化率低，是由于1次加入硒使起始环境的硒浓度偏高，对红发夫酵母的抑制作用相对较强，不利于红发夫酵母出芽，影响红酵母对有机硒的转化；分2次添加的方式使得硒浓度在红发夫酵母生长初期较低，對红发夫酵母群体生长的抑制作用较弱，随着红发夫酵母生长速度加快，红发夫酵母的数量逐渐增加，富硒能力也逐渐增强[11-12]，因此，选用2次添加Na2SeO3的方式。

2.6 正交试验优化

前期单因素试验结果表明，硒添加量、培养时间和装液量对红发夫酵母的有机硒转化率影响较大，所以正交试验选取硒添加量、培养时间、装液量为因素，以有机硒转化率为考察指标，进行L9（34）正交试验，以确定对红发夫富硒酵母富硒的最优条件参数。

由表2可知，对红发夫酵母有机硒转化的影响由主到次依次是硒添加量（A）、培养时间（B）、装液量（C），硒添加量是最主要的影响因素。从级差分析的R值可以看出，红发夫酵母的最佳富硒条件是A2B2C1，此时有机硒的转化率达63.2%，即最适硒添加量为20 mg/L，最佳培养时间为30 h，最适装液量为80 mL/500 mL，在该条件下通过验证试验得出红发夫酵母的生物量和有机硒转化率最优，分别达10.62 g/L和63.2%。

3 结论

通过红发夫酵母的富硒条件研究，得出了适于红酵母生长和富硒的培养条件，结果表明，在PDA培养基中红发夫酵母生长旺盛，分2次添加硒溶液将更利于有机硒的转化，最佳培养条件为：装液量80 mL/500 mL，硒添加浓度20 mg/L，培养时间30 h。在上述条件下，培养有机硒转化率达632%。尽管硒添加量是对酵母富硒性能影响最大的因素，然而硒含量的提高主要来自于生物量的提高，因此在实际生产过程中，要提高有机硒的转化率，还应综合考虑总生物量提高的影响。目前，红发夫酵母主要应用于胡萝卜素的生产和生产单细胞蛋白等方面，将红发夫酵母应用于富硒研究并得到附加值更高的富硒酵母产品，具有广阔的应用前景。

参考文献

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