番鸭细小病毒玍P3基因的原核表达及鉴定

吴萌 王安平 吴海涛

摘要[目的]使番鸭细小病毒（DPV）VP3在原核表达系统中正确表达。[方法]根据番鸭细小病毒 VP3基因序列，设计一对特异性引物，利用PCR技术扩增出VP3基因；将其克隆至原核表达载体pET-32a，获得重组表达载体pET-32a-VP3。将重组质粒转化感受态细胞BL21（DE3），经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测重组蛋白。[结果]成功表达出与预期大小相符的重组蛋白，约89 kDa；且当IPTG浓度为1.2 mmol/L，诱导时间为6 h时蛋白表达量最大。[结论]该研究通过原核表达系统成功表达了DPV、VP3蛋白，并摸索了蛋白最佳表达条件。

关键词番鸭细小病毒；VP3基因；原核表达

中图分类号S852.65+7文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）35-0124-04

Abstract[Objective]To prepare the prokaryotic expression of VP3gene of Muscovy duck parvovirus.[Method]One pair of specific primers was designed to amplify VP3 gene by PCR.The amplified fragments were cloned into prokaryotic expression vector pET32a，and the recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21（DE3）cells.The protein was expressed following IPTG induction，and detected by the SDSPAGE.[Result]The recombinant protein matched with the expected result was successfully expresssed，the size of the recombinant protein was about 89 kDa.When the concentration of IPTG was 1.2 mmol/L，the time was 6 h，the expression of protein was the largest.[Conclusion]The expression of VP3 protein of DPV was successfully expressed through the prokaryotic expression system，and the best expression conditions were explored.

Key wordsMuscovy duck parvovirus；VP3 gene；Prokaryotic expression

番鴨细小病毒病是由番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，DPV）引起的主要侵害3周龄以内雏番鸭的疫病[1-3]。该病在很多国家和地区均有流行，以腹泻、喘气和脚软为主要症状[4]。该病的发病率较高、传播迅速、造成番鸭大量死亡，且病鸭痊愈后机能障碍，成为僵鸭。DPV属于细小病毒科依赖病毒属，为单股线性DNA病毒。基因组全长约5.1 kb，含有2个开放阅读框（Open Reading Frame；ORF），左侧ORF编码非结构蛋白NS，右侧编码结构蛋白。其中，VP3是最主要的结构蛋白，约占总蛋白的80%，能刺激机体产生抗体，是诱导机体产生保护性抗体的主要抗原[5]。该试验通过原核表达系统成功表达DPV VP3蛋白，并摸索蛋白最佳表达条件，以期为进一步研究番鸭细小病毒奠定基础。

1材料与分析

1.1材料

1.1.1病毒与菌种。DPV尿囊液、新城疫病毒（NDV）尿囊液、pET-32a载体、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）均由江苏省农牧科技职业学院省兽用生物制药高技术重点实验室保存。

1.1.2酶类和主要试剂。

Pfu DNA Polymerase、限制性核酸内切酶BamH Ⅰ、Sac Ⅰ及T4 DNA连接酶、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒和DNB显色液购自康为世纪生物科技有限公司；蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Ampicillin）购自Sigma公司。

1.1.3主要仪器。PCR仪（Applied Biosystems公司）；台式低温离心机（HITACHI公司）；生化培养箱（宁波江南仪器厂）；DYY-10C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；凝胶成像系统（Tanon公司）；超声波裂解仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；SDS-PAGE电泳仪及TE70X半干转印装置（BIO-RAD公司）；紫外分光光度计（HITACHI公司）。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成。

参考GenBank中已发表的DPV VP3衣壳蛋白基因序列，设计1对用于扩增VP3基因的引物（上游插入BamH I酶切位点，下游插入Sac I酶切位点），由北京英潍捷基生物技术有限公司合成。引物序列为VP3-pET-F：5-TATGGATCCATGGCAGAGGGAGCAAGC-3， VP3-pET-R：5-TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC-3，产物大小为1 602 bp。

1.2.2VP3目的基因的合成。

将含有DPV的鸡胚尿囊液煮沸10 min，-20 ℃冷冻10～20 min， 4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液为PCR模板。PCR反应体系（25 μL）如下：

模板DNA 1 μL；PrimerF、PrimerR（25 mmol/ L）各1 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；dNTP（2.5 mmol/ L）2.5 μL；Pfu DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL；dd H2O 16.5 μL。

PCR反应循环参数为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30～35个循环后，72 ℃终延伸10 min。反应结束后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

1.2.3重组表达载体pET-32a-VP3的构建。

1.2.3.1目的基因VP3与载体pET-32a的连接。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的基因，将目的基因VP3和质粒pET-32a分别经BamH I和Sac I双酶切。回收酶切后的目的片段VP3和质粒pET-32a，经T4 DNA连接酶连接，连接体系（10 μL）如下：10×Buffer 1 μL；T4 DNA Ligase 0.5 μL；pET-32a 2 μL；目的片段VP3 5 μL；ddH2O 1.5 μL。22 ℃作用90 min，连接产物直接用于转化。

1.2.3.2连接产物转化感受态细胞。

根据《分子克隆实验指南》（第3版）[6]所述，采用氯化钙法制备CaCl2感受态细胞，以每管125 μL分装。取連接产物3 μL加至1管DH5α感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃热休克90 s，迅速冰浴2 min，而后加入800 μL LB培养基，37 ℃、140 r/min培养1 h。取200 μL菌液涂布于含有Amp+100 μg/mL的LB平板上， 37 ℃培养箱培养12～16 h。

1.2.3.3重组质粒的酶切鉴定及测序。

随机挑取上述平板中数个单菌落，分别接种于5 mL 含Amp+100 μg/mL的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min摇床培养过夜。取过夜菌为模板，VP3-pET-F、VP3-pET-R为上下游引物，进行PCR。将PCR初步鉴定为阳性的菌株提取质粒，获得重组质粒pET-32a-VP3。

将重组质粒pET-32a-VP3分别经BamH I单酶切以及BamH I和Sac I双酶切，双酶切反应体系（40 μL）如下：

重组质粒30 μL；BamH Ⅰ 0.5 μL；Sac Ⅰ 0.5 μL；10×Buffer BamH Ⅰ 4 μL；10×Buffer Sac Ⅰ 4 μL；ddH2O 1 μL。单酶切反应体系（40 μL）如下：重组质粒30 μL；BamH Ⅰ 0.5 μL；10×Buffer BamH Ⅰ 4 μL；ddH2O 5.5 μL。37 ℃水浴3～4 h，取10 μL酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将酶切鉴定正确的重组菌送至测序公司测序，测序后正确的即为阳性重组表达载体pET-32a-VP3。

1.2.4重组蛋白的诱导表达及鉴定。

1.2.4.1重组蛋白的诱导表达。

将鉴定正确的表达载体pET-32a-VP3的重组质粒和载体pET-32a质粒分别转化BL21（DE3）感受态细胞。挑取重组菌BL21（pET-32a-VP3）及宿主菌BL21（pET-32a）单菌落，接种于5 mL含有Amp+ 100 μg/mL的LB液体培养基，37 ℃、220 r/min 培养过夜，即为种子液。

12～16 h后，将种子液分别转接种于5 mL含有Amp+的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min摇床培养约3 h，当OD600达0.6～0.8时，向其中分别加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），37 ℃、220 r/min摇床中继续培养6 h。

1.2.4.2表达条件的优化。

（1）IPTG浓度的优化。将种子液转接种于30 mL含有Amp+的LB液体培养基，37 ℃、220 r/min振摇培养。当OD600等于0.6时，将30 mL菌液平均分装到6支试管，向其中分别加入IPTG（终浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L），37 ℃、220 r/min摇床中继续培养6 h。

（2）诱导时间的优化。将种子液转接种于30 mL含有Amp+的LB液体培养基，37 ℃、220 r/min培养。当OD600等于0.6时，向其中加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），在37 ℃、220 r/min摇床中继续培养。当诱导时间为2、4、6、8 h及过夜后，分别收集5 mL诱导的菌液。

1.2.4.3重组蛋白SDS-PAGE分析和Western blot检测。

将上述菌液分别离心，收集菌体，而后冰浴中超声波裂解，离心，取上清，沉淀以500 μL PBS重悬。分别取裂解上清液、沉淀与5×SDS Loading Buffer混合，煮沸10 min，上样进行SDS-PAGE分析。

并对重组蛋白和空载体蛋白进行Western blot检测，以5%脱脂乳封闭，以抗His标签蛋白的鼠单抗为检测一抗，在DAB显色试剂盒作用下显色观察结果。

2结果与分析

2.1VP3基因的克隆PCR结果经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，出现1条大小约1 600 bp的条带，与预期相符，初步判断为目的片段VP3，结果见图1。

2.2重组表达载体pET-32a-VP3的构建与酶切鉴定

将重组质粒经BamH Ⅰ和Sac Ⅰ 双酶切，琼脂糖凝胶电泳后，产生与预期大小相符的2个条带，分别为1 600、5 900 bp；经BamH Ⅰ 单酶切后产生1条约7 500 bp大小的片段，与预期结果相符。测序结果显示，目的片段VP3序列正确，且阅读框正确，酶切鉴定结果见图2。

2.3重组蛋白pET-32a-VP3的SDS-PAGE分析

重组菌BL21（pET-32a-VP3）经IPTG诱导表达，收集菌体，以PBS溶液重悬，超声裂解，SDS-PAGE分析。结果表明，重组菌获得了表达，蛋白大小约89 kDa，与预期结果相符，且以包涵体形式存在，SDS-PAGE结果见图3。重组蛋白能与His标签蛋白的鼠单抗特异性反应，在约89 kDa处出现条带（图4）。

2.4表达条件的优化

重组菌BL21（pET-32a-VP3）随着诱导剂IPTG浓度的增加，重组蛋白的表达量逐渐增加，当IPTG的总浓度为1.2 mmol/L时，蛋白表达量达顶峰，结果见图5。

重组菌BL21（pET-32a-VP3）随着诱导时间的增加，重组蛋白表达量增加，当诱导时间达6 h时，表达量最大（图6）。

3结论与讨论

番鸭细小病毒（DPV）的VP基因相互重叠，虽然起始密码子不在同一位置，但终止密码子在同一位点。编码3种结构蛋白VP1、VP2、VP3的基因起始密码子分别位于2 450、2 885、3 044 nt[7]，所以VP1含有组成VP2、VP3的全部氨基酸序列， VP2在蛋白酶的作用下裂解出VP3。VP3是最主要的结构蛋白，能刺激机体产生保护性抗体[8]。

该研究将番鸭细小病毒的VP3基因克隆到pET-32a载体上，在原核表达体系中经IPTG诱导，表达出大小约89 kDa的VP3重组蛋白；且当IPTG浓度为1.2 mmol/L，诱导时间为6 h时蛋白表达量最大。

该研究成功获得了DPV重组蛋白，为DPV 的研究以及番鸭细小病毒疫苗的研制提供了参考资料。

参考文献

[1]

林世棠，郁晓岚，陈炳钿，等.一种新的雏番鸭病毒性传染病的诊断[J].中国畜禽传染病，1991（2）：25-26.

[2] 程由铨，林天龙，胡奇林，等.雏番鸭细小病毒病的病毒分离和鉴定[J].病毒学报，1993，9（3）：228-235.

[3] 董嘉文，李林林，孙敏华.雏番鸭细小病毒病研究进展[J].养禽与禽病防治，2012（10）：2-6.

[4] 阮二垒，陈芳艳，陈瑞爱，等.雏番鸭细小病毒病的研究进展[J].中国动物检疫，2009，26（5）：68-70.

[5] 余兵，王永坤，朱国强，等.番鸭细小病毒M91G27株病毒结构蛋白VP3编码基因的克隆与鉴定[J].中国预防兽医学报，2000，22（6）：409-411.

[6] 李载平.分子克隆实验指南（第3版）[J].科学通报，2002，47（24）：1888.

[7] 程由銓，胡奇林，陈少莺，等.番鸭细小病毒和鹅细小病毒生化及基因组特性的比较[J].中国兽医学报，2001，21（5）：429-433.

[8] 孟松树，王永坤.番鸭细小病毒特性的初步研究[J].江苏农学院学报，1994，15（4）：52-57.