铁树种子提取物的抑菌活性

袁素素　秦武洒　张耀　张玮玮　叶秀娟

摘要[目的]研究铁树种子提取物的抑菌活性。[方法]采用纸片扩散法、牛津杯法、琼脂稀释法和荧光染色法，研究提取物抑菌活性。[结果]提取物具有光谱抗菌活性，对禾谷镰刀菌的IC50为1.65 mg/mL，对其分生孢子的IC50为2.93 mg/mL，改变禾谷镰刀菌菌丝尖端几丁质的量和线粒体内膜负电性。[结论]提取物具有较好的抑菌活性。

关键词苏铁；种子提取物；病原菌；抑菌活性

中图分类号S-3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）31-0012-03

Abstract[Objective]The aim was to study antibacterial activity of extract of Cycas siamensis seed. [Method]The antibacterial activity of extract of Cycas siamensis seed was studied by filter paper method， agar dilution method and fluorescent staining method. [Result]The extract had a broadspectrum antibacterial activity， and the IC50 of Fusarium graminearum and spores were 1.65 and 2.93 mg/mL. The extracts changed hypha chitin and mitochondrial membrane potential. [Conclusion]The extract has stronger antibacterial activity.

Key wordsCycas siamensis；Seed extracts；Pathogenic bacteria；Antibacterial activity

蘇铁（Cycas siamensis），在我国又名莎树或欀木，是距今2亿年前地质历史时期的裸子植物[1]。苏铁茎杆高大，供人采食淀粉，但多食有害[2]，常作为药用本草，又名继之、铁蕉、凤蕉、凤尾蕉（松）等。苏铁广泛分布于全球热带、亚热带地区，我国分布1属10种，其中5种已经被林业部列为国家级濒危保护植物[1]。目前，苏铁植物常作为园林和庭院观赏树种[3]，苏铁的种子可药用[4]。笔者研究了铁树种子提取物的抑菌活性，旨在为保护和利用苏铁植物提供新思路。

1材料与方法

1.1材料

10种供试菌：小白菜炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）、烟草炭疽病菌（Colletotrichum micotianae）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、玉米小斑病菌（Helminthosporium maydis）、芭乐炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）、凸脐蠕孢菌（Exserohilum monoceras）、落花生球腔菌（Mycosphaerella arachidicola），均由福建农林大学教育部重点实验室提供。

23种人体肠道病原细菌：ATCC10987蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus），ATCC29212粪肠球菌（Enterococcus faecali），ATCC27270屎肠球菌（Enterococcus faecium），CMCC26069表皮葡萄球菌（Staphylococcus），ATCC29521两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum），ATCC11774枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），ATCC1911、CMCC54004单核增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes），CMCC（B）28001藤黄微球菌（Micrococcus luteus），ATCC29213金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），ATCC25944阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii），ATCC10536、ATCC8739、ATCC25922、O157：H7、K7大肠杆菌（Escherichia coli），CMCC（B）49005奇异变形杆菌（Micrococcus luteus），ATCC9027铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa），ATCC12076沙门氏菌（Salmonella），ATCC12022福氏志贺氏菌（Shigella flexneri），CMCC51252痢疾志贺氏菌，ATCC17202副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），CMCC（B）52204小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica），均由福建福州市疾病预防控制中心提供。

铁树种子采自福建农林大学校园，去除种皮，洗净，晾干备用。

1.2方法

1.2.1提取物的提取。

100 g铁树种子加入400 mL水进行匀浆，4 ℃过夜，8 000 r/min离心30 min，浸提2次，收集上清液冷冻干燥，得提取物干粉备用。

1.2.2抗真菌活性检测。

采用纸片扩散法，将10种植物病原真菌接种于培养皿中，28 ℃恒温培养，待真菌生长的圆面直径为3 cm时，将已灭菌的滤纸圆片置于距菌边缘0.5 cm处，在滤纸片上加入15 μL提取物溶液，以无菌水为对照，继续培养至菌丝长至滤纸片边缘时，观察有无抑菌结果。

1.2.3抗细菌活性检测。

采用牛津杯法，将50 μL细菌溶液加入含有5 mL脑心浸液肉汤（BHI）液体培养基的试管中，37 ℃、150 r/min活化12 h后备用。加热100 mL 1.5% BHI固体培养基，倒入10～12个培养皿（90 mm×15 mm）中冷凝。将100 μL活化细菌溶液加入20 mL温度为45～50 ℃的07%BHI固体培养基中并混匀，细菌浓度约为1×108 CFU/mL，倒入含有5个牛津杯的水平平板中冷凝，然后拔出牛津杯。1孔加入50 μL 1 mg/mL制真菌素为阳性对照，1孔加入50 μL无菌水为阴性对照，3孔加入粗提液，4 ℃冰箱过夜后，置于37 ℃恒温培养箱中6～12 h，观察有无抑菌活性。

1.2.4禾谷镰刀菌的半抑制浓度（IC50）测定。

采用琼脂平板稀释法，准确称量待测样品，用无菌水配成不同浓度溶液，过0.22 μm的滤头除菌。加热融化0.7%马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，待冷却至40～50 ℃时，分别吸取0.5 mL上述样品溶液和无菌水分别与1.5 mL 0.7%PDA培养基于培养皿（30 mm×15 mm）中混匀。取直径6 mm禾谷镰刀菌菌饼置于平皿中心位置，28 ℃恒温培养至对照组真菌长至平皿边缘时，用十字交叉法测量真菌的生长直径并计算提取物对禾谷镰刀菌的IC50，每个处理3个重复。运用SPSS统计学软件对试验数据进行单因素方差分析和Probit回归分析，计算IC50。

菌丝生长抑制率=（对照组菌丝生长面积-处理组菌丝生长面积）/对照组菌丝生长面积×100%

1.2.5抗禾谷镰刀菌分生孢子萌发活性测定。

1.2.5.1禾谷镰刀菌分生孢子制备。

将禾谷镰刀菌接种于羧甲基纤维素钠（CMC）液体培养基中，28 ℃、150 r/min条件下摇床培养4～5 d，过滤取孢子，用无菌水将孢子稀释成约1×106 CFU/mL，将等体积的0.05%葡萄糖溶液与孢子溶液混合备用。

1.2.5.2禾谷镰刀菌分生孢子的IC50测定。

采用凹玻片法，准确称量待测样品，用无菌水配成不同浓度的样品溶液，过0.22 μm滤头除菌。处理组为20 μL样品溶液与20 μL上述孢子悬浮液混匀，对照组为20 μL无菌水与20 μL的上述孢子悬浮液混匀。加于凹玻片中央，并置于有2层无菌水浸湿滤纸片的培养皿（90 mm×15 mm）中，28 ℃恒温保湿培养至对照组孢子萌发率在90%以上时，用光学显微镜观察并记录各组孢子的萌发情况，每个处理至少观察300个孢子，每个处理3次重复。运用SPSS统计学软件对试验数据进行单因素方差分析和Probit回归分析，计算IC50。

分生孢子萌发率=分生孢子萌发数/观察分生孢子数×100%

分生孢子萌发抑制率=（对照组分生孢子萌发率-处理组分生孢子萌发率）/对照组萌发率×100%

1.2.6荧光染色试验。

将禾谷镰刀菌接种于马铃薯葡萄糖（PD）水培养基中，28 ℃、150 r/min条件下摇床培养24 h。吸取含有菌丝的PD水培养基与等量含有提取物溶液混合，提取物终浓度为8.7 mg/mL，对照组为PBS缓冲液，继续培养过夜。用刚果红染料和罗丹明染液分别处理对照组和样品组。刚果红黑暗条件下染色1 h，罗丹明染色30 min，多余的染液用PBS缓冲液清洗，制作玻片，共聚焦显微镜和荧光显微镜观察并拍照。

1.2.7提取物稳定性试验。

1.2.7.1

pH稳定性。称取1 mg提取物溶于200 μL无菌水中。分别吸取10 μL提取物溶液和90 μL pH 为2、3、4、5、6、8、9、10、11、12的缓冲液，混匀，静置30 min，以苹果黑腐皮壳菌为指示菌，用紙片扩散法检测有无抑菌活性。

1.2.7.2

存放时间稳定性。称取5 mg提取物溶于1 mL无菌水中。分别取100 μL铁树果提取物溶液于6个1.5 mL离心管中，在20 ℃恒温下密封保存，并每隔3 d

取1管置于-20 ℃下保存备用，以苹果黑腐皮壳菌为指示菌，用纸片扩散法检测有无抑菌活性。

2结果与分析

2.1铁树种子提取物的抗真菌活性

由图1可知，铁树果提取物对尖孢镰刀菌、苹果黑腐皮壳菌、禾谷镰刀菌、茄病镰刀菌和小白菜炭疽病菌5种植物病原真菌具有抑制活性，并且对禾谷镰刀菌的抑菌活性较强。

2.2禾谷镰刀菌的IC50

禾谷镰刀菌的IC50检测结果（图

2）表明，随着铁树提取物和百菌清浓度的升高，对禾谷镰刀

菌的抑制作用随之加强。由表1可知，提取物对禾谷镰刀菌的IC50为1.650 0 mg/mL，百菌清对禾谷镰刀菌的IC50为0004 7 mg/mL，可见，提取物对禾谷镰刀菌的抑制效果较百菌清弱。

2.3禾谷镰刀菌分生孢子的IC50

提取物对禾谷镰刀菌分生孢子具有抑制活性，进而检测提取物对禾谷镰刀菌孢子的IC50。由图3可知，在提取物浓度为0.23 mg/mL时，对禾谷镰刀菌孢子的萌发反而有促进作用，之后随着提取物浓度的增大，对禾谷镰刀菌孢子的抑制活性增强。运用SPSS软件对数据进行进一步处理，得到提取物对禾谷镰刀菌分生孢子的Probit回归方程为：Probit（p）=0.741+1.585x，IC50为2.93 mg/mL。

2.4荧光染色试验结果

刚果红染色试验中，通过观察图4中箭头指示菌丝尖端染色情况，提取物处理组的禾谷镰刀菌菌丝尖端有明显红色荧光，荧光强度强于对照组。在荧光绿染色试验结果（图5）中，提取物处理组荧光强度明显强于对照组，因此推测提取物在作用于禾谷镰刀菌时，使菌丝尖端几丁质的量和线粒体内膜的电负性发生变化，对禾谷镰刀菌的生长产生不利影响。

2.5提取物穩定性检测

以苹果黑腐皮壳菌作为指示菌，检测提取物的稳定性。由图6可知，提取物20 ℃放置12 d时具有抑制真菌的活性，放置15 d时抑菌活性丧失。由图7可知，在不同pH（pH 2～12）处理后，提取物对真菌仍具有抑制活性。试验结果表明，提取物具有耐酸碱、易于贮存的特性。

2.6抗人体肠道病原细菌活性

采用牛津杯法检测提取物对人体肠道病原细菌的抑制活性。结果表明，铁树种子提取物对5种大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌具有抑制活性。

3结论与讨论

苏铁作为观赏植物，在园林中应用较多，研究多集中于铁树的栽培和管理[5]，铁树的种子常用于育苗[6]。铁树种子作为中药，具有广谱抗菌活性，对多种植物病原真菌和人体肠道病原细菌都具有抑制活性。陶文琴等[7]研究表明，苏铁蕨的根状茎水提液[1 g（生药）/mL]对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制活性。在铁树种子中分离得到3种抗菌肽，能抑制尖孢镰刀菌和白地霉2种植物病原真菌，以及马铃薯环腐病菌、萎蔫短小杆菌和发根农杆菌等植物病原细菌的生长[8]。此外，人们也发现种子中存在具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的蛋白[9]和Ⅴ型几丁质酶[10]。综上，铁树种子中存在多种活性物质，进一步拓宽了铁树的潜在应用价值，值得进一步研究和挖掘。

参考文献

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[2] 潘春记，徐芸锋，潘雷灵，等.铁树果急性中毒38例临床分析[J].中国当代医药，2014，21（6）：158-159.

[3] 陈少萍.朱蕉栽培管理[J].中国花卉园艺，2015（6）：27-29.

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[8] YOKOYAMA S，KATO K，KOBA A，et al.Purification，characterization，and sequencing of antimicrobial peptides，CyAMP1，CyAMP2，and CyAMP3，from the Cycad（Cycas revoluta）seeds[J].Peptides，2008，29（12）：2110-2117.

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