鸡绿脓杆菌的分离鉴定与毒力试验

秦绪伟 王蕾 刁有祥

摘要：2015年～2016年临床上从鸡场分离到15株绿脓杆菌，进行细菌的鉴定，调查鸡群中绿脓杆菌的血清型，了解鸡群发病情况，鸡群中绿脓杆菌主要存在三种血清型，其中G型最多，有11株，占总数的73.3%，B型次之，有3株，占总数的20%，C型最少，1株，占总数的6.7%。分离菌株进行小白鼠的毒力试验，观察绿脓杆菌的毒力，不同菌株对小白鼠的毒力不一样，其中G型最小致死剂量2X107CFU/0.3ml，B型最小致死剂量5X107CFU/0.3ml，C型最小致死剂量10X107CFU/0.3ml。

关键词：鸡；绿脓杆菌；鉴定；毒力

中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：2096-3637（2017）04-0006-03

绿脓杆菌病是由绿脓杆菌引起的一种人畜共患病。绿脓杆菌又叫绿脓假单胞菌，属于假单胞菌科假单胞菌属。绿脓杆菌是一种条件致病菌，常见的眼观症状是在感染后可见到绿色的浓汁，所以称为绿脓杆菌。机体抵抗力低的时候容易发病，特别是集约化养殖的鸡场以及鸭场绿脓杆菌的发病率较高，常常引起急性败血症死亡[1]。绿脓杆菌革兰氏阴性小杆菌，不产生芽孢，只有一根鞭毛，显微镜运动活泼。广泛分布于土壤、水和空气中，潮湿的污水中常年存在，该菌营养要求比较低，一般的环境都可以生长，可感染众多哺乳动物、禽类、爬行类和鱼类[2]，一般情况下健康的人和动物不患病，但是在机体抵抗力低下时容易引发绿脓杆菌病，有时是天气变化、转群、疫苗免疫等等应激因素促进该病的发生。雏鸡容易感染绿脓杆菌[3]，造成严重的经济损失，感染后的症状主要是发病急促、病程短、精神沉郁、衰竭、脱水、皮下水肿[4]。绿脓杆菌容易检测和治疗，但是使用抗菌药物治疗后，原来的敏感抗菌药物容易变成耐药[5]，疫苗的使用將是以后的研究方向。

1 材料和方法

1.1 试验菌株

2015年～2016年从发病养殖场分离到的绿脓杆菌15株

1.2 试验动物

18～22g小白鼠，购自山东大学实验动物中心； 7日龄鸡，购自济南章丘某养殖场。

1.3 器材

生物安全柜，蘇净安泰，型号BSC-1600IIA2；基因扩增仪，杭州博日科技有限公司，型号TC-96/G/H（b）c；显微镜，奥林巴斯，型号CX-31；恒温培养箱，三洋，型号MCO-15AC；全自动样品快速研磨仪，上海净信科技，型号Tiss-24。

微量药敏片，购自杭州天和生物试剂有限公司；绿脓菌素鉴定培养基、营养琼脂、麦康凯琼脂、马丁肉汤粉，购自青岛海博试剂公司；细菌微量生化反应小管，购自北京路桥试剂公司； B型、C型、G型绿脓菌素阳性定型鉴定血清，购自日本力生株式会社；牛血清，购自济南劲牛试剂公司；高压锅、超声波清洗机、解剖台、解剖刀、剪刀、酒精灯、接种环、试管，实验室常备物品。

1.3.1细菌分离与鉴定

发现精神沉郁、衰竭、脱水，眼睛肿、皮下水肿病鸡进行检测，着重检测绿脓杆菌，无菌条件下取肝脏，接种10%血清的营养琼脂平板， 37℃温箱培养16h，观察细菌细菌生长情况。疑似绿脓杆菌的菌落再进行细菌革兰氏染色，观察细菌形态，转接绿脓菌素鉴定培养基、麦康凯琼脂、绵羊鲜血培养基，记录细菌状况和生长特性。

1.4 生化试验

将分离的疑似绿脓杆菌的细菌全部进行生化试验。

1.4.1氧化酶试验

加2滴1%四甲基对苯二胺试剂于滤纸上，用牙签挑去1个菌落到纸上涂布，若5s内由粉色变为黑色，则判为阳性。

1.4.2触酶试验

取干净的载玻片，在上面滴加1%过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的分离菌，在过氧化氢溶液中混合，若有气泡则触酶试验阳性。

1.4.3硝酸盐还原试验

先制备溶液，甲液：甲基萘胺0.6g，5mol/L冰醋酸100ml，稍加热，脱脂棉过滤，放棕色瓶。乙液：对氨基苯磺酸0.8g，用5mol/L冰醋酸30ml溶解对氨基苯磺酸，定溶至100ml，放带玻璃瓶塞的玻璃瓶中。

把菌接种在硝酸盐培养基中，37℃培养24h，加甲液和乙液各3滴，30s出现红色则为阳性，若无颜色加少量的锌，随后出现红色则为阴性。

1.4.4脂酶试验

将菌接种在含维多利亚蓝的脂酶中，35℃培养24h，培养基颜色变为蓝色，则脂酶试验阳性，无颜色或者粉色则为阴性。

1.4.5甲基红试验

将菌接种在葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48h，于5ml培养基中滴加5滴甲基红指示剂，立即观察结果，培养液出现红色为阳性，黄色为阴性。

1.4.6VP试验

将菌接种葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24h，加入50gL-萘酚0.6ml，轻轻振摇试管，然后加入0.2ml400g/L KOH，轻轻振摇30min，然后静止观察结果，15min后呈现红色的为阳性，不变颜色的为阴性。

1.4.7硫化氢试验

将待检菌接种含硫化物及亚铁离子的培养基中，35℃孵育18h，若有黑色沉淀出现，判为阳性。

1.4.8明胶液化试验

将菌接种明胶培养基，35℃孵育24h至7日，每24h取样放入4℃冰箱2h，观察有无凝固，若呈现液态不凝固，判为阳性。

1.4.9吲哚试验

将菌液接种富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃培养24～48h，加入试剂中，若形成玫瑰吲哚而成红色，结果判定为吲哚试验阳性。

1.4.10糖发酵试验

从琼脂斜面上挑取少量待检物，接种糖发酵管培养物，37℃培养2～3日，每日记录观察结果。

1.5 血清型鉴定

分别取血清B型、C型、G型阳性定型血清一滴滴于载玻片，用接种环挑取少量营养琼脂平板上的菌落在血清中混合均匀，3min后观察血清有无凝集，与何种血清凝集的细菌评定为哪一种型，与B型阳性血清凝集的细菌则判定B型绿脓杆菌，与C型阳性血清凝集的细菌则判定C型绿脓杆菌，与G型阳性血清凝集的细菌则判定G型绿脓杆菌。

1.6 毒力试验

1.6.1小白鼠毒力试验

将分离的15株绿脓杆菌接种血清营养琼脂平板，37℃培养24h后，接种马丁肉汤培养基，37℃摇床培养16h，将菌液稀释成1X108CFU/0.3ml，2X108CFU/0.3ml，5X108CFU/0.3ml，分别腹腔注射5只，0.3ml/只，攻毒后观察7d，记录小鼠死亡情况。

1.6.2G型16004、B型15005和C型15006小白鼠毒力试验

选取G型和B型中毒力最强的两株细菌，降低攻毒剂量，摸索小白鼠的最小致死量。将分离的绿脓杆菌G型16004和B型15005、C型15006接种血清营养琼脂平板，37℃培养24h后，接种马丁肉汤培养基，37℃摇床培养16h，将菌液稀释成1X107CFU/0.3ml，2X107CFU/0.3ml，5X107CFU/0.3ml，分别腹腔注射5只，0.3ml/只，攻毒后观察7d，记录小鼠死亡情况。

1.6.3 绿脓杆菌G型16004、B型15005和C型15006对7日龄鸡毒力试验

选取G型和B型中毒力最强的两株细菌，降低攻毒剂量，摸索7日龄鸡最小致死量。将分离的绿脓杆菌G型16004和B型15005、C型15006接种血清营养琼脂平板，37℃培养24h后，接种马丁肉汤培养基，37℃摇床培养16h，将菌液稀释成1X108CFU/ml，2X108CFU/ml，5X108CFU/ml，分别腹腔注射鸡5只，1ml/只，攻毒后观察7d，记录鸡发病死亡情况。

2 结果

2.1 细菌分离和培养特性结果

2015年～2016年从全国不同地区的鸡养殖场疑似绿脓杆菌的肝脏分离出15株疑似绿脓杆菌的菌株，其中2015年7株，2016年8株。

15株分菌检测均符合绿脓杆菌的形态学特征，在营养琼脂平板上生长，为圆形、光滑、湿润、扁平的菌落，有单鞭毛，无荚膜、无芽孢，镜检革兰氏染色细菌呈现阴性小杆菌，两端钝圆，单个存在，有的成双排列；麦康凯上生长，呈現灰白色菌落；绵羊鲜血琼脂平板上，能产生明显的溶血环；在绿脓菌素鉴定培养基上生长，产生绿色素，菌落为浅绿色。

2.2 生化试验结果

分离的细菌氧化酶、触酶、硝酸盐、脂酶试验阳性，吲哚、M.R、VP和硫化氢试验阴性，水解明胶，发酵葡萄糖，不发酵乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖，符合绿脓杆菌的生化特性。（具体结果见表1）

2.3 血清型鉴定结果

每一个分离的菌株在血清平板纯化后，使用玻片凝集法分别与B型、C型、G型阳性定型血清进行凝集试验，与B型阳性血清凝集的细菌则判定B型绿脓杆菌，与C型阳性血清凝集的细菌则判定C型绿脓杆菌，与G型阳性血清凝集的细菌则判定G型绿脓杆菌，2015年与2016年分离15株的细菌分别属于3个血清型，其中G型11株，占总数的73.3%，B型3株，占总数的20%，C型1株，占总数的6.7%。（具体结果见表2）

2.4 毒力实验结果

2.4.1小白鼠毒力试验结果

15株分离菌，分别进行1X108CFU/0.3ml，2X108CFU/0.3ml，5X108CFU/0.3ml剂量腹腔注射5只，攻毒后观察7只，其中G型细菌攻毒后死亡最多死亡最快毒力最强的是16004，最低1X108CFU/0.3ml 剂量3天可以致死全部小白鼠，其他编号菌株相对较弱，B型细菌攻毒后死亡最多死亡最快毒力最强的是15005，最低1X108CFU/0.3ml 剂量3天可以致死全部小白鼠，其他编号菌株相对较弱，C型细菌15006， 1X108CFU/0.3ml攻毒组死亡4只，毒力较弱。（具体结果见表3）

2.4.2G型16004、B型15005和C型15006小白鼠毒力试验结果

取绿脓杆菌G型16004和B型15005、C型15006培养液，将菌液稀释成1X107CFU/0.3ml，2X107CFU/0.3ml，5X107CFU/0.3ml，10X107CFU/0.3ml，分别腹腔注射5只，0.3ml/只，攻毒后观察7d，G型 16004最小致死剂量2X107CFU/0.3ml，B型15005最小致死剂量5X107CFU/0.3ml，C型15006最小致死剂量10X107CFU/0.3ml。（具体结果见表4）

2.4.3绿脓杆菌G型16004、B型15005和C型15006对7日龄鸡毒力试验结果

取绿脓杆菌G型16004和B型15005、C型15006培养液，将菌液稀释成1X108CFU/ml，2X108CFU/ml，5X108CFU/ml，分别腹腔注射5只1ml/只，攻毒后观察7d，每天观察记录鸡发病死亡情况，G型 16004最小致死剂量2X108CFU/ml，B型15005最小致死剂量5X108CFU/ml，C型15006最小致死剂量5X108CFU/ml。（具体结果见表5）

3 小结与讨论

3.1 绿脓杆菌广泛存在 江河、湖泊、土壤、空气中常年可以分离到，多种动物容易感染，不同的动物感染后的症状不同，集约化养殖的畜禽群容易感染，可以引发败血症、肺炎、关节炎，甚至死亡，给畜牧业带来严重的经济损失。在人有创伤、烧伤时绿脓杆菌容易感染，造成伤口化脓感染，不容易愈合，是临床上人常见的条件致病菌。鸡养殖场容易感染，主要是雏鸡感染，有的鸡蛋本身感染，有的是孵化室感染，1日龄注射马立克疫苗或者7日龄注射油苗時容易一起感染绿脓杆菌，引起死亡，表现为注射疫苗后鸡群有的发病。

3.2 临床上鸡的绿脓杆菌发病 主要是引起肺炎、包心包肝、关节炎和眼炎，各种年龄都容易得，但是绿脓杆菌发病率不高、死亡不大，养殖场关注点和怀疑的方向一般不是绿脓杆菌，再就是绿脓杆菌与其他疾病症状相似，不进行细菌分离很难确诊，容易误诊。打疫苗后有发病死亡的，怀疑应激；有包心包肝的，怀疑大肠杆菌；有眼睛肿的，怀疑鸡鼻炎；有关节炎瘫痪的，怀疑链球菌和滑液囊支原体；有皮下水肿的，怀疑葡萄球菌，确诊需要细菌的分离鉴定。

3.3 绿脓杆菌血清型众多 不同的分类方式也不同，各个血清型毒力也不同，有的有较强的致死性，有的发病症状比较轻。2015年与2016年2年从鸡场病死鸡中分离到15株绿脓杆菌，其中11株G型，3株B型，1株C型，G型占比例最大，占总数的73.3%。绿脓杆菌虽然是环境致病菌，但是致病性较强，毒力强的菌株对小白鼠的最小致死剂量2X107CFU/0.3ml。养殖场发病后可以使用抗生素治疗，但是青霉素、链霉素、红霉素等对绿脓杆菌有天然的耐药性，一般喹诺酮类药物对绿脓杆菌敏感，可以使用。

3.4 绿脓杆菌成分比较复杂 有外毒素、胞外酶、菌毛、弹性蛋白酶，都是重要的毒力因子，因此在不同动物感染后出现不同的致病症状，与其相关的毒力因子有关，绿脓杆菌感染后不同的毒力因子调节，造成绿脓杆菌的复杂性。本实验初步分离了15株绿脓杆菌，进行了血清型的鉴定，对养鸡场的绿脓杆菌发病情况有了初步的了解，有助于后期对鸡的绿脓杆菌疫苗的研发。

参考文献

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