鸡绿脓杆菌的分离鉴定与毒力试验

2017-05-30 10:48秦绪伟王蕾刁有祥
畜牧兽医科学 2017年4期
关键词:绿脓杆菌鉴定毒力

秦绪伟 王蕾 刁有祥

摘要:2015年~2016年临床上从鸡场分离到15株绿脓杆菌,进行细菌的鉴定,调查鸡群中绿脓杆菌的血清型,了解鸡群发病情况,鸡群中绿脓杆菌主要存在三种血清型,其中G型最多,有11株,占总数的73.3%,B型次之,有3株,占总数的20%,C型最少,1株,占总数的6.7%。分离菌株进行小白鼠的毒力试验,观察绿脓杆菌的毒力,不同菌株对小白鼠的毒力不一样,其中G型最小致死剂量2X107CFU/0.3ml,B型最小致死剂量5X107CFU/0.3ml,C型最小致死剂量10X107CFU/0.3ml。

关键词:鸡;绿脓杆菌;鉴定;毒力

中图分类号:S858.31 文献标识码:B 文章编号:2096-3637(2017)04-0006-03

绿脓杆菌病是由绿脓杆菌引起的一种人畜共患病。绿脓杆菌又叫绿脓假单胞菌,属于假单胞菌科假单胞菌属。绿脓杆菌是一种条件致病菌,常见的眼观症状是在感染后可见到绿色的浓汁,所以称为绿脓杆菌。机体抵抗力低的时候容易发病,特别是集约化养殖的鸡场以及鸭场绿脓杆菌的发病率较高,常常引起急性败血症死亡[1]。绿脓杆菌革兰氏阴性小杆菌,不产生芽孢,只有一根鞭毛,显微镜运动活泼。广泛分布于土壤、水和空气中,潮湿的污水中常年存在,该菌营养要求比较低,一般的环境都可以生长,可感染众多哺乳动物、禽类、爬行类和鱼类[2],一般情况下健康的人和动物不患病,但是在机体抵抗力低下时容易引发绿脓杆菌病,有时是天气变化、转群、疫苗免疫等等应激因素促进该病的发生。雏鸡容易感染绿脓杆菌[3],造成严重的经济损失,感染后的症状主要是发病急促、病程短、精神沉郁、衰竭、脱水、皮下水肿[4]。绿脓杆菌容易检测和治疗,但是使用抗菌药物治疗后,原来的敏感抗菌药物容易变成耐药[5],疫苗的使用將是以后的研究方向。

1 材料和方法

1.1 试验菌株

2015年~2016年从发病养殖场分离到的绿脓杆菌15株

1.2 试验动物

18~22g小白鼠,购自山东大学实验动物中心; 7日龄鸡,购自济南章丘某养殖场。

1.3 器材

生物安全柜,蘇净安泰,型号BSC-1600IIA2;基因扩增仪,杭州博日科技有限公司,型号TC-96/G/H(b)c;显微镜,奥林巴斯,型号CX-31;恒温培养箱,三洋,型号MCO-15AC;全自动样品快速研磨仪,上海净信科技,型号Tiss-24。

微量药敏片,购自杭州天和生物试剂有限公司;绿脓菌素鉴定培养基、营养琼脂、麦康凯琼脂、马丁肉汤粉,购自青岛海博试剂公司;细菌微量生化反应小管,购自北京路桥试剂公司; B型、C型、G型绿脓菌素阳性定型鉴定血清,购自日本力生株式会社;牛血清,购自济南劲牛试剂公司;高压锅、超声波清洗机、解剖台、解剖刀、剪刀、酒精灯、接种环、试管,实验室常备物品。

1.3.1细菌分离与鉴定

发现精神沉郁、衰竭、脱水,眼睛肿、皮下水肿病鸡进行检测,着重检测绿脓杆菌,无菌条件下取肝脏,接种10%血清的营养琼脂平板, 37℃温箱培养16h,观察细菌细菌生长情况。疑似绿脓杆菌的菌落再进行细菌革兰氏染色,观察细菌形态,转接绿脓菌素鉴定培养基、麦康凯琼脂、绵羊鲜血培养基,记录细菌状况和生长特性。

1.4 生化试验

将分离的疑似绿脓杆菌的细菌全部进行生化试验。

1.4.1氧化酶试验

加2滴1%四甲基对苯二胺试剂于滤纸上,用牙签挑去1个菌落到纸上涂布,若5s内由粉色变为黑色,则判为阳性。

1.4.2触酶试验

取干净的载玻片,在上面滴加1%过氧化氢溶液,挑取一环斜面培养的分离菌,在过氧化氢溶液中混合,若有气泡则触酶试验阳性。

1.4.3硝酸盐还原试验

先制备溶液,甲液:甲基萘胺0.6g,5mol/L冰醋酸100ml,稍加热,脱脂棉过滤,放棕色瓶。乙液:对氨基苯磺酸0.8g,用5mol/L冰醋酸30ml溶解对氨基苯磺酸,定溶至100ml,放带玻璃瓶塞的玻璃瓶中。

把菌接种在硝酸盐培养基中,37℃培养24h,加甲液和乙液各3滴,30s出现红色则为阳性,若无颜色加少量的锌,随后出现红色则为阴性。

1.4.4脂酶试验

将菌接种在含维多利亚蓝的脂酶中,35℃培养24h,培养基颜色变为蓝色,则脂酶试验阳性,无颜色或者粉色则为阴性。

1.4.5甲基红试验

将菌接种在葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中,35℃孵育48h,于5ml培养基中滴加5滴甲基红指示剂,立即观察结果,培养液出现红色为阳性,黄色为阴性。

1.4.6VP试验

将菌接种葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中,35℃孵育24h,加入50gL-萘酚0.6ml,轻轻振摇试管,然后加入0.2ml400g/L KOH,轻轻振摇30min,然后静止观察结果,15min后呈现红色的为阳性,不变颜色的为阴性。

1.4.7硫化氢试验

将待检菌接种含硫化物及亚铁离子的培养基中,35℃孵育18h,若有黑色沉淀出现,判为阳性。

1.4.8明胶液化试验

将菌接种明胶培养基,35℃孵育24h至7日,每24h取样放入4℃冰箱2h,观察有无凝固,若呈现液态不凝固,判为阳性。

1.4.9吲哚试验

将菌液接种富含色氨酸的蛋白胨水培养基中,35℃培养24~48h,加入试剂中,若形成玫瑰吲哚而成红色,结果判定为吲哚试验阳性。

1.4.10糖发酵试验

从琼脂斜面上挑取少量待检物,接种糖发酵管培养物,37℃培养2~3日,每日记录观察结果。

1.5 血清型鉴定

分别取血清B型、C型、G型阳性定型血清一滴滴于载玻片,用接种环挑取少量营养琼脂平板上的菌落在血清中混合均匀,3min后观察血清有无凝集,与何种血清凝集的细菌评定为哪一种型,与B型阳性血清凝集的细菌则判定B型绿脓杆菌,与C型阳性血清凝集的细菌则判定C型绿脓杆菌,与G型阳性血清凝集的细菌则判定G型绿脓杆菌。

1.6 毒力试验

1.6.1小白鼠毒力试验

将分离的15株绿脓杆菌接种血清营养琼脂平板,37℃培养24h后,接种马丁肉汤培养基,37℃摇床培养16h,将菌液稀释成1X108CFU/0.3ml,2X108CFU/0.3ml,5X108CFU/0.3ml,分别腹腔注射5只,0.3ml/只,攻毒后观察7d,记录小鼠死亡情况。

1.6.2G型16004、B型15005和C型15006小白鼠毒力试验

选取G型和B型中毒力最强的两株细菌,降低攻毒剂量,摸索小白鼠的最小致死量。将分离的绿脓杆菌G型16004和B型15005、C型15006接种血清营养琼脂平板,37℃培养24h后,接种马丁肉汤培养基,37℃摇床培养16h,将菌液稀释成1X107CFU/0.3ml,2X107CFU/0.3ml,5X107CFU/0.3ml,分别腹腔注射5只,0.3ml/只,攻毒后观察7d,记录小鼠死亡情况。

1.6.3 绿脓杆菌G型16004、B型15005和C型15006对7日龄鸡毒力试验

选取G型和B型中毒力最强的两株细菌,降低攻毒剂量,摸索7日龄鸡最小致死量。将分离的绿脓杆菌G型16004和B型15005、C型15006接种血清营养琼脂平板,37℃培养24h后,接种马丁肉汤培养基,37℃摇床培养16h,将菌液稀释成1X108CFU/ml,2X108CFU/ml,5X108CFU/ml,分别腹腔注射鸡5只,1ml/只,攻毒后观察7d,记录鸡发病死亡情况。

2 结果

2.1 细菌分离和培养特性结果

2015年~2016年从全国不同地区的鸡养殖场疑似绿脓杆菌的肝脏分离出15株疑似绿脓杆菌的菌株,其中2015年7株,2016年8株。

15株分菌检测均符合绿脓杆菌的形态学特征,在营养琼脂平板上生长,为圆形、光滑、湿润、扁平的菌落,有单鞭毛,无荚膜、无芽孢,镜检革兰氏染色细菌呈现阴性小杆菌,两端钝圆,单个存在,有的成双排列;麦康凯上生长,呈現灰白色菌落;绵羊鲜血琼脂平板上,能产生明显的溶血环;在绿脓菌素鉴定培养基上生长,产生绿色素,菌落为浅绿色。

2.2 生化试验结果

分离的细菌氧化酶、触酶、硝酸盐、脂酶试验阳性,吲哚、M.R、VP和硫化氢试验阴性,水解明胶,发酵葡萄糖,不发酵乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖,符合绿脓杆菌的生化特性。(具体结果见表1)

2.3 血清型鉴定结果

每一个分离的菌株在血清平板纯化后,使用玻片凝集法分别与B型、C型、G型阳性定型血清进行凝集试验,与B型阳性血清凝集的细菌则判定B型绿脓杆菌,与C型阳性血清凝集的细菌则判定C型绿脓杆菌,与G型阳性血清凝集的细菌则判定G型绿脓杆菌,2015年与2016年分离15株的细菌分别属于3个血清型,其中G型11株,占总数的73.3%,B型3株,占总数的20%,C型1株,占总数的6.7%。(具体结果见表2)

2.4 毒力实验结果

2.4.1小白鼠毒力试验结果

15株分离菌,分别进行1X108CFU/0.3ml,2X108CFU/0.3ml,5X108CFU/0.3ml剂量腹腔注射5只,攻毒后观察7只,其中G型细菌攻毒后死亡最多死亡最快毒力最强的是16004,最低1X108CFU/0.3ml 剂量3天可以致死全部小白鼠,其他编号菌株相对较弱,B型细菌攻毒后死亡最多死亡最快毒力最强的是15005,最低1X108CFU/0.3ml 剂量3天可以致死全部小白鼠,其他编号菌株相对较弱,C型细菌15006, 1X108CFU/0.3ml攻毒组死亡4只,毒力较弱。(具体结果见表3)

2.4.2G型16004、B型15005和C型15006小白鼠毒力试验结果

取绿脓杆菌G型16004和B型15005、C型15006培养液,将菌液稀释成1X107CFU/0.3ml,2X107CFU/0.3ml,5X107CFU/0.3ml,10X107CFU/0.3ml,分别腹腔注射5只,0.3ml/只,攻毒后观察7d,G型 16004最小致死剂量2X107CFU/0.3ml,B型15005最小致死剂量5X107CFU/0.3ml,C型15006最小致死剂量10X107CFU/0.3ml。(具体结果见表4)

2.4.3绿脓杆菌G型16004、B型15005和C型15006对7日龄鸡毒力试验结果

取绿脓杆菌G型16004和B型15005、C型15006培养液,将菌液稀释成1X108CFU/ml,2X108CFU/ml,5X108CFU/ml,分别腹腔注射5只1ml/只,攻毒后观察7d,每天观察记录鸡发病死亡情况,G型 16004最小致死剂量2X108CFU/ml,B型15005最小致死剂量5X108CFU/ml,C型15006最小致死剂量5X108CFU/ml。(具体结果见表5)

3 小结与讨论

3.1 绿脓杆菌广泛存在 江河、湖泊、土壤、空气中常年可以分离到,多种动物容易感染,不同的动物感染后的症状不同,集约化养殖的畜禽群容易感染,可以引发败血症、肺炎、关节炎,甚至死亡,给畜牧业带来严重的经济损失。在人有创伤、烧伤时绿脓杆菌容易感染,造成伤口化脓感染,不容易愈合,是临床上人常见的条件致病菌。鸡养殖场容易感染,主要是雏鸡感染,有的鸡蛋本身感染,有的是孵化室感染,1日龄注射马立克疫苗或者7日龄注射油苗時容易一起感染绿脓杆菌,引起死亡,表现为注射疫苗后鸡群有的发病。

3.2 临床上鸡的绿脓杆菌发病 主要是引起肺炎、包心包肝、关节炎和眼炎,各种年龄都容易得,但是绿脓杆菌发病率不高、死亡不大,养殖场关注点和怀疑的方向一般不是绿脓杆菌,再就是绿脓杆菌与其他疾病症状相似,不进行细菌分离很难确诊,容易误诊。打疫苗后有发病死亡的,怀疑应激;有包心包肝的,怀疑大肠杆菌;有眼睛肿的,怀疑鸡鼻炎;有关节炎瘫痪的,怀疑链球菌和滑液囊支原体;有皮下水肿的,怀疑葡萄球菌,确诊需要细菌的分离鉴定。

3.3 绿脓杆菌血清型众多 不同的分类方式也不同,各个血清型毒力也不同,有的有较强的致死性,有的发病症状比较轻。2015年与2016年2年从鸡场病死鸡中分离到15株绿脓杆菌,其中11株G型,3株B型,1株C型,G型占比例最大,占总数的73.3%。绿脓杆菌虽然是环境致病菌,但是致病性较强,毒力强的菌株对小白鼠的最小致死剂量2X107CFU/0.3ml。养殖场发病后可以使用抗生素治疗,但是青霉素、链霉素、红霉素等对绿脓杆菌有天然的耐药性,一般喹诺酮类药物对绿脓杆菌敏感,可以使用。

3.4 绿脓杆菌成分比较复杂 有外毒素、胞外酶、菌毛、弹性蛋白酶,都是重要的毒力因子,因此在不同动物感染后出现不同的致病症状,与其相关的毒力因子有关,绿脓杆菌感染后不同的毒力因子调节,造成绿脓杆菌的复杂性。本实验初步分离了15株绿脓杆菌,进行了血清型的鉴定,对养鸡场的绿脓杆菌发病情况有了初步的了解,有助于后期对鸡的绿脓杆菌疫苗的研发。

参考文献

[1]夏咸柱.野生动物疫病学[M].高等教育出版社,2011:756-766.

[2]陆承平.兽医微生物学[M].第五版.中国农业出版社,2013:152-153.

[3]崔治中.兽医全攻略鸡病[M].中国农业出版社,2009:222-226.

[4]吴清民.兽医传染病学[M].中国农业大学出版社,2002:293-295.

[5]周庭银.临床微生物学诊断与图解[M].第三版.上海科学技术出版社.2012:229-231.

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