马尾松毛虫高毒力球孢白僵菌菌株的生物学特性

刘晓晓 王星冉 王义勋 黄俊斌 陈京元 郑露

摘要：【目的】研究馬尾松毛虫高毒力球孢白僵菌菌株的生物学特性，为利用球孢白僵菌对马尾松毛虫进行生物防治及大规模生产球孢白僵菌提供理论依据。【方法】在PDA培养基上测定6个温度梯度（17、20、23、26、29和32 ℃）对供试球孢白僵菌高毒力菌株（B-2、B-14和B-19）生长速率、产孢量及孢子萌发率的影响；以查比克培养基为基础，分别以等质量的3种不同碳源或氮源代替蔗糖和硝酸钾，测定不同碳、氮源对供试球孢白僵菌高毒力菌株生长速率、产孢量及孢子萌发率的影响。【结果】供试菌株在不同温度条件下的生长存在一定差异，过高或过低均不利于B-2、B-14和B-19菌株菌丝生长、产孢及孢子萌发，在26 ℃下各项生物学指标均达最高值，菌株的生长速率、产孢量和孢子萌发率分别为3.36～3.77 mm/d、9.33×104～16.33×104个/mL和92.67%～99.67%；在不同碳氮源利用方面，最适生长、产孢的碳源为葡萄糖，菌丝生长速率和产孢量分别为3.56～4.35 mm/d、1.00×104～1.33×104个/mL，但孢子萌发率普遍不高；最适生长的氮源为蛋白胨，菌丝生长速率为4.40～4.81 mm/d；最适产孢及孢子萌发的氮源为酵母浸出液，产孢量和孢子萌发率分别为5.67×104～51.33×104个/mL、58.03%～100.00%。【结论】B-2菌株可优先选作球孢白僵菌工业化生产菌种；在26 ℃下选择葡萄糖和酵母浸出液为碳氮源可提高菌剂的生产效率。

关键词： 球孢白僵菌；高毒力菌株；马尾松毛虫；生物学特性

中图分类号： S763.421 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-1019-05

Biological characteristics of highly virulent strains of Beauveria bassiana for Dendrolimus punctatus

Abstract：【Objective】Biological characteristics of highly virulent strains of Beauveria bassiana were tested to provide theoretical basis for production and biocontrol of B. bassiana against Dendrolimus punctatus. 【Method】Effects of six different temperatures（17， 20， 23， 26， 29 and 32 ℃） on growth rate， sporulation quantity and spore germination rate of highly virulent strains of B. bassiana（B-2， B-14 and B-19） were measured respectively on PDA media. With Czapek media as the base， sucrose and potassium nitrate were replaced by three kinds of carbon sources or nitrogen sources of the same mass， in order to study the effects of different carbon sources and nitrogen sources on growth rate， sporulation quantity and spore germination rate of highly virulent strains of B. Bassiana. 【Result】The three tested strains grew differently under different temperatures. Extremely high and low temperatures were not beneficial to mycelial growth， sporulation and spore germination of B. bassiana strains. All biological indicators could reach the highest level under 26 ℃. The growth rate， sporulation quantity and spore germination rate were 3.36-3.77 mm/d， 9.33×104-16.33×104/mL and 92.67%-99.67% respectively. In terms of carbon sources application， glucose was the most suitable for growth and sporulation， with growth rate of 3.56-4.35 mm/d and sporulation quantity of 1.00-1.33×104/ml， but spore germination rate was low. Peptone was the best nitrogen source for mycelial growth（4.40-4.81 mm/d） and yeast extract was the most suitable for sporulation（sporulation quantity 5.67×104-

51.33×104/mL） and spore germination（spore germination rate 58.03%-100.00%）. 【Conclusion】Strain B-2 can be preferentially selected for industrial production of B. bassiana. At temperature 26 ℃， carbon source glucose and nitrogen source yeast extract can increase production effeciency of B. bassiana.

Key words： Beauveria bassiana； highly virulent strain； Dendrolrimus punctatus； biological characteristic

0 引言

【研究意义】马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus）是我国南方松树林中发生最严重的一种森林害虫，主要为害马尾松、湿地松、火炬松和黑松等松属植物，松树一旦受害，轻则松针枯黄卷曲，发生严重时形似火烧，松林大片枯死（陈顺立等，2004）。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一种广谱性杀虫真菌，林间应用时对人畜无害，安全环保，也因其较强的杀虫活性被广泛应用于松毛虫等多种农林害虫的防治（Feng et al.，1994）。不同球孢白僵菌菌株产孢量高低、孢子萌发快慢及多少等与其毒力存在密切的相关性（王成树等，1998）。因此，研究马尾松毛虫高毒力球孢白僵菌菌株的生物学特性，对应用球孢白僵菌防治马尾松毛虫具有重要意义。【前人研究进展】前人对不同球孢白僵菌菌株的生物学特性已有较多报道。邝灼彬等（2005）测试了6个温度对球孢白僵菌菌株（分离自小猿叶甲成虫）生长速率、产孢量及孢子萌发率的影响，结果表明，在17～26 ℃范围内，随着温度的升高，该菌株的菌落生长速率、产孢量、孢子萌发率均升高，26 ℃最有利于该菌株的生长、产孢及孢子萌发，在32 ℃下该菌株不能生长。熊琦等（2012）研究表明，分离自桃小食心虫幼虫上的球孢白僵菌菌株TST05在15～35 ℃范围内均能生长和产孢，在20～30 ℃范围内菌落直径和产孢量相对较高。不同的营养条件也会影响球孢白僵菌菌丝生长及产孢水平，适宜的营养能促进菌丝快速生长及产孢，增强杀虫活性（李农昌等，1996；姚剑和黄大庆，2005）。球孢白僵菌菌株Bb13生长的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨（程国华等，2006）；而球孢白僵菌HFW-05菌株生长的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为豆粕粉（陆晴等，2008）。齐永霞等（2011）研究表明，球孢白僵菌Bb06菌株对单糖、双糖和多糖等多种碳营养及有机氮和无机氮等多种氮营养均能够利用，但利用程度存在一定差异。【本研究切入点】球孢白僵菌菌株的生长、产孢及孢子萌发与环境和营养条件有关，但不同菌株其生物学特性存在一定差异，因此很有必要对筛选到的马尾松毛虫高毒力球孢白僵菌菌株生物学特性进行研究。【拟解决的关键问题】以前期筛选到的马尾松毛虫高毒力球孢白僵菌菌株B-2、B-14和B-19为材料，研究不同温度、碳源和氮源条件对球孢白僵菌菌株生长速率、产孢量及孢子萌发率的影响，旨在优化球孢白僵菌的大规模工业化生产工艺，为利用球孢白僵菌防治马尾松毛虫提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

马尾松毛虫高毒力球孢白僵菌菌株B-2、B-14和B-19由华中农业大学植物真菌病害实验室筛选获得（王义勋等，2016）。菌株寄主及地理来源信息详见表1。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 不同温度对球孢白僵菌高毒力菌株生长、产孢及孢子萌发的影响 在培养3 d且生长一致的菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，分别置于17、20、23、26、29和32 ℃的培养箱中培养，每处理重复3皿，光照条件设为12 h光照/12 h黑暗。采用十字交叉法测量菌落直径，每隔2 d测量一次，直到第10 d，计算菌株生长速率（mm/d）。

打取直径5 mm的菌丝块接种于PDA培养基上，在不同温度条件下培养10 d的菌落中心打取一块直径5 mm的菌丝块，放入装有50 mL无菌水的小烧杯中，用磁力搅拌器搅拌15 min，使孢子充分分散，采用血球计数板计数并计算产孢量（个/mL）。

各菌株在PDA培养基上培养10 d后，分别用无菌水收集孢子，制成孢子悬浮液（每视野约100个孢子），将孢子悬浮液滴在无菌载玻片上，放入铺有湿润滤纸的培养皿内，置于不同温度下培养，每处理重复3次。24 h后镜检孢子萌发情况，统计孢子萌发数并计算孢子萌发率（%）；每个重复至少镜检50个孢子。

1. 2. 2 不同碳源对球孢白僵菌高毒力菌株生长、产孢及孢子萌发的影响 以查比克培養基（0.50 g KCl，30.00 g蔗糖， 0.50 g MgSO4， 2.00 g KNO3， 0.01 g FeSO4， 1.00 g KH2PO4，2%琼脂粉，蒸馏水1000 mL）为基础培养基（方中达，2007），分别用等质量碳元素的麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉代替蔗糖，接入直径5 mm的菌丝块，25 ℃条件下培养，参照1.2.1方法测量供试菌株的生长速率（mm/d）、产孢量（个/mL）和孢子萌发率（%）。

1. 2. 3 不同氮源对球孢白僵菌高毒力菌株生长、产孢及孢子萌发的影响 以查比克培养基为基础培养基，分别用等质量氮元素的蛋白胨、牛肉膏、酵母浸出液代替硝酸钾，接入直径5 mm的菌丝块，25 ℃条件下培养，参照1.2.1方法测量供试菌株的生长速率（mm/d）、产孢量（个/mL）和孢子萌发率（%）。

1. 3 统计分析

采用DPS v7.05对试验数据进行方差分析，用LSD法比较各处理的差异显著性。

2 结果与分析

2. 1 不同温度对球孢白僵菌菌株生长、产孢及孢子萌发的影响

3株供试球孢白僵菌菌株在6个温度梯度下均能生长、产孢及孢子萌发，但不同温度或菌株间存在一定差异（表2）。在17～26 ℃下，供试菌株的生长速率、产孢量及孢子萌发率均随着温度的升高而升高；在26 ℃下各项生物学指标均达最高值；随着温度的继续升高，各项指标均有所下降。总体来说，26～29 ℃最适于球孢白僵菌的生长、产孢及孢子萌发，温度过高或过低均不利于球孢白僵菌的生长、产孢及孢子萌发。

在26 ℃下比较3株球孢白僵菌菌株的生长速率、产孢量及孢子萌发率，发现以B-2菌株的生长速率最高，为3.77 mm/d，显著高于其他2株菌株（P<0.05，下同）；B-14菌株的产孢量最高，为16.33×104个/mL，显著高于B-2菌株，但与B-19菌株差异不显著（P>0.05，下同）；3株供试菌株（B-2、B-14和B-19）的孢子萌发率无显著差异，分别为92.67%、95.88%和99.67%。

2. 2 不同碳源对球孢白僵菌菌株生长、产孢及孢子萌发的影响

3株供试菌株在不同碳源培养基上的生长速率、产孢量及孢子萌发率存在一定差异（表3）。总体而言，葡萄糖作为碳源时，供试3株菌株生长速率最快、产孢量最大、孢子萌发率也最高，其中B-14菌株的生长速率最高，显著高于B-2菌株，但与B-19菌株无显著差异；B-2菌株的孢子萌发率最高，为44.45%，显著高于其他2株菌株；3株菌株（B-2、B-14和B-19）的产孢量无显著差异，分别为1.33×104、1.00×104和1.33×104个/mL。

2. 3 不同氮源对球孢白僵菌菌株生长、产孢及孢子萌发的影响

3株供试菌株在不同氮源培养基上的生长速率、产孢量及孢子萌发率存在一定差异（表4）。总体来说，以蛋白胨作为氮源时，供试菌株的生长速率均达最高值，其中B-14菌株生长速率最高，为4.81 mm/d，显著高于B-19菌株，但与B-2菌株无显著差异。酵母浸出液作为氮源时，供试菌株产孢量和孢子萌发率均达最高值，其中B-19菌株的产孢量最高，为51.33×104个/mL，显著高于其他2株菌株； B-19和B-2菌株的孢子萌发率最高，均为100.00%，显著高于B-14菌株。可见，3株供试菌株在以蛋白胨为氮源的培养基上生长较好，以酵母浸出液为氮源最有利于供试球孢白僵菌菌株的产孢及孢子萌发。

3 讨论

不同温度条件下球孢白僵菌的营养生长和产孢能力有所不同（徐艳聆等，2009）。本研究发现，球孢白僵菌高毒力菌株（B-2、B-14和B-19）的最适生长、产孢及孢子萌发温度均为26 ℃，与前人研究结果（邝灼彬等，2005）一致；不同的是B-2、B-14和B-19菌株在32 ℃時仍能正常生长，可能是不同地理来源菌株对温度的适应能力存在差异；本研究中3株高毒力球孢白僵菌菌株对高温适应能力较强，更有利于保证菌剂在林间的稳定性。综合前人研究结果及本研究结果可知，温度过高或过低均不利于菌株的生长、产孢及孢子萌发，因此，在实际应用中应注意施用地温度，尽量选择在合适的季节施用，从而保证菌株活性及防治效果。

除温度条件影响外，营养成分也是影响白僵菌菌株生长的重要因素之一（唐晓庆等，1996；James，2001；齐永霞等，2011）。球孢白僵菌对单糖、双糖和多糖等碳营养及有机氮、无机氮等氮营养均能够利用，但不同菌株间的利用程度存在一定差异（齐永霞，2011）。程国华等（2006）研究表明，球孢白僵菌菌株Bb13生长的最佳碳、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨；陆晴等（2008）研究发现，球孢白僵菌菌株HFW-05生长的最佳碳、氮源分别为蔗糖和豆粕粉。本研究供试碳源中以单糖葡萄糖最适合球孢白僵菌菌株生长、产孢及孢子萌发，可能是单糖相对于双糖和多糖更有利于球孢白僵菌吸收；本研究选用的氮源均为有机态氮，但球孢白僵菌在菌丝生长、产孢及孢子萌发等不同生长发育阶段所需的最优氮源存在差异，可能与不同的信号通路和代谢途径相关。

此外，球孢白僵菌菌种在继代培养时常表现出产孢量降低、致病力减退等现象（唐晓庆等，1996）。对球孢白僵菌高毒力菌株B-2、B-14和B-19的毒力稳定性及遗传稳定性有待进一步研究。

4 结论

综合3株球孢白僵菌高毒力菌株在生长、产孢及孢子萌发率方面的生物学性状，B-2菌株可优先选作球孢白僵菌工业化生产菌种；在26 ℃下选择葡萄糖和酵母浸出液为碳氮源可提高菌剂的生产效率。

参考文献：

陈顺立，林庆源，黄金聪. 2004. 南方主要树种害虫综合管理[M]. 厦门：厦门大学出版社：113-119. [Chen S L， Lin Q Y， Huang J C. 2004. Integrated Pest Management for Maojor Trees in Southern China[M]. Xiamen： Xiamen University Press： 113-119.]

程国华，舒静，丁克坚. 2006. 球孢白僵菌营养需求及培养条件研究[J]. 中国农学通报，22（5）：365-368. [Cheng G H， Shu J， Ding K J. 2006. Study on nutrition demand and culture condition of Beauveria bassiana[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，22（5）： 365-368.]

方中达. 2007. 植病研究法[M]. 第3版北京：中国农业出版社：50. [Fang Z D. 2007. Research Methods of Plant Patho-

logy[M]. The 3rd Edition Beijing： China Agriculture Press： 50.]

邝灼彬，吕利华，冯夏，陈焕瑜，武亚敬，何余容. 2005. 温度及常见农药对球孢白僵菌生物学特性的影响[J]. 华南农业大学学报，26（3）：26-29. [Kuang Z B， Lü L H， Feng X， Chen H Y， Wu Y J， He Y R. 2005. Effect of temperatures and chemical pesticides on the biological characteristics of Beauveria bassiana[J]. Journal of South China Agricultural University， 26（3）： 26-29.]

李农昌，樊美珍，李春如，李华，高智輝，朱润德. 1996. 白僵菌有关培养条件及其与毒力关系的研究[J]. 安徽农业大学学报，23（3）：254-259. [Li N C，Fan M Z，Li C R，Li H，Gao Z H，Zhu R D. 1996. Relationship between culture conditions and virulence of Beauveria bassiana[J]. Journal of Anhui Agricultural University， 23（3）： 254-259.]

陆晴，曹伟平，董建臻，王金耀，冯书亮，王容燕，杜立新. 2008. 不同碳、氮营养对球孢白僵菌HFW-05的生长及胞外蛋白酶产量的影响[J]. 华北农学报，23（5）：142-146. [Lu Q， Cao W P， Dong J Z， Wang J Y， Feng S L， Wang R Y， Du L X. 2008. Effects of different carbon and nitrogen sources on the growth and extracellular protease production of Beauveria bassiana HFW-05[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 23（5）： 142-146.]

齐永霞，陈方新，李增智. 2011. 不同碳、氮营养对球孢白僵菌生物学特性和抑菌活性的影响[J]. 激光生物学报，20（1）：38-44. [Qi Y X， Chen F X， Li Z Z. 2011. Effects of carbon sources and nitrogen sounces on the biological characteristics and antifungal activity of Beauveria bassiana[J]. Acta Laser Biological Sinica， 20（1）： 38-44.]

唐晓庆，樊美珍，李增智. 1996. 球孢白僵菌继代培养中菌落局变现象及环境影响因素的研究[J]. 真菌学报，15（3）：188-196. [Tang X Q， Fan M Z， Li Z Z. 1996. Study on saltation of Beauveria bassiana，an important entomogenous fungus， subcultured in different conditions[J]. Mycosystema， 15（3）： 188-196.]

王成树，王四宝，李增智. 1998. 球孢白僵菌高毒菌株筛选模型的研究[J]. 农业生物技术学报，6（3）：245-249. [Wang C S， Wang S B， Li Z Z. 1998. Screening model for selec-

ting virulent strains of Beauveria bassiana[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 6（3）：245-249.]

王义勋，王星冉，陈京元，黄俊斌，郑露. 2016. 马尾松毛虫高毒力白僵菌菌株筛选[J]. 南方农业学报，47（5）：662-666. [Wang Y X， Wang X R， Chen J Y， Huang J B， Zheng L. 2016. Screening of highly virulent Beauveria bassiana Walker strains against Dendrolimus punctatus[J]. Journal of Southern Agriculture， 47（5）： 662-666.]

熊琦，朱永敏，曹天文，李捷，薛皎亮，谢映平，王全亮，杜仙当. 2012. 桃小食心虫病原菌—球孢白僵菌TST05菌株生物学特性研究[J]. 植物保护学报，38（2）：87-91. [Xiong Q， Zhu Y M， Cao T W， Li J， Xue J L， Xie Y P， Wang Q L， Du X D. 2012. Biological characteristics of the entomo-

pathogenic fungus of Carposina sasakii，Beauveria bassiana strain TST05[J]. Journal of Plant Protection，38（2）：87- 91.]

徐艳聆，吕文彦，赵润洲，陈营. 2009. 环境对球孢白僵菌生物学特性的影响[J]. 河南农业科学，（8）：95-97. [Xu Y L， Lü W Y， Zhao R Z， Chen Y. 2009. Effects of environmental factors on the biological characteristics of Beauveria bassiana[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， （8）： 95-97.]

姚剑，黄大庆. 2005. 球孢白僵菌脂肪酸、酯酶、脂肪酶及其与毒力的关系[J]. 中国生物防治，21（3）：167-171. [Yao J， Huang D Q. 2005. The correlationship between fatty acid composition， ester and lipidase production and virulence of Beauveria bassiana against Dendrolimu spunctatus[J]. Chinese Journal of Biological Control， 21（3）： 167-171.]

Feng M G， Poprawski T J， Khachatourians G G. 1994. Production， formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control： Current status [J]. Biocontrol Science and Technology，4（1）： 3-34.

James R R. 2001. Effects of exogenous nutrients on conidial germination and virulence against the silverleaf whitefly for two hyphomycetes[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 77（2）： 99-107.

（责任编辑 麻小燕）