墨兰‘达摩’叶艺品系光合色素含量、叶绿素荧光特性和叶绿体超微结构的比较

许庆全　杨凤玺　叶庆生　朱根发

摘 要 墨蘭叶色变异品系具有较高的观赏和经济价值，但其叶色变异机理尚不清楚。对墨兰栽培品系‘达摩正常绿叶及其4个叶色变异（叶艺）品系的叶片光合色素含量和叶绿素荧光动力学参数进行比较，发现叶艺品系叶片黄色区域的总叶绿素和类胡萝卜素含量均小于绿色区域，且叶绿素含量降低更为显著，造成Caro/Chl升高，叶色黄化。叶绿素荧光参数显示叶艺品系叶片黄色区域的Fv/Fm、NPQ值也有相应降低，而qp、Y（Ⅱ）值比绿色区域高，可能与其高比例的叶绿素a和类胡萝卜素含量相关。进一步对叶绿体超微结构进行分析，发现叶艺品系叶片绿色区域叶绿体存在不同程度发育缺陷，而黄色区域的叶绿体退化更为严重，没有完整的叶绿体结构。此外，研究结果显示，叶艺品系叶片绿色区域Fv/Fm值的变化趋势与其叶绿体发育完整程度具有一致性，qp、Y（Ⅱ）值与总叶绿素和类胡萝卜素含量变化趋势一致，但黄色区域并不呈现出这种相关性，可能与叶绿体发育严重受损有关。

关键词 墨兰；叶色变异；叶绿素含量；叶绿素荧光动力学参数；叶绿体超微结构

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract Though leaf mutant cultivars of Cymbidium sinense‘Damohave a high ornamental and economic value，the mechanism of mutant is still unknown. The photosynthetic pigments content， chlorophyll fluorescence kinetics parameters of‘Green Damoand four leaf mutants of‘Damowere compared and analyzed. The content of carotenoid and chlorophyll on the yellow part of the mutant leaves were significantly less than that of the green part respectively. The content of chlorophyll was much lower， leading to the increase of Caro/Chl ratio and leaf yellowing. The determination of chlorophyll fluorescence kinetics parameters showed Fv/Fm and NPQ values on the yellow parts were lower accordingly， while qp and Y（Ⅱ）values were higher， indicating that the result was related to the high ratio of the chlorophyll a and carotenoid. The further observation of chloroplast ultrastructure observation found that the integrity degrees of chloroplast development on the green part of different mutants varied and chloroplast structures were damaged more severely on the yellow part. The result showed Fv/Fm values of green parts went with the integrity degrees of chloroplast development. qp and Y（Ⅱ）values were consistent with content of chlorophyll and carotinoid. However， Fv/Fm， qp and Y（Ⅱ）values on the yellow part did not show such a consistency， indicating that the result may arise from the severely damaged chloroplast structure on the yellow part of the mutant leaves.

Key words Cymbidium sinense； leaf mutants； photosynthetic pigments content； chlorophyll fluorescence kinetics parameters； chloroplast ultrastructure

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.006

高等植物的叶片中主要含有叶绿素和类胡萝卜素，因叶绿素含量通常大于类胡萝卜含量从而使得植物叶片呈现绿色[1]。叶色突变体往往由于叶绿素合成或降解直接或间接受到突变基因的影响而导致叶绿素含量变化，故此类突变体通常被称为叶绿素突变体[2]。墨兰是中国传统名贵花卉，叶艺性状具有极高的观赏价值。其中栽培品系‘达摩叶色变异尤为丰富，目前已培育出30多个不同叶色变异的品种[3-4]。朱根发等[5]，李冬梅等[6]、分别利用AFLP、RAPD分子标记证明‘达摩不同叶色变异品种间存在DNA水平的多态性。Zhu等[7]基于454测序平台和de novo组装拼接技术在‘达摩中鉴定出95个与叶色变异相关的候选基因，并成功克隆出16个与叶绿素代谢相关的基因。从生理学角度分别研究了全绿叶‘达摩及其叶艺品系叶片黄色区域和绿色区域的叶绿素含量、叶绿素荧光动力参数和叶绿体超微结构，为探究墨兰‘达摩叶色变异的生理机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选用广东省农业科学院环境园艺研究所温室中生长状况良好、长势基本一致的5个墨兰‘达摩栽培品系作为试验材料，包括绿叶‘达摩、‘达摩冠艺、‘达摩斑缟艺、‘达摩宝艺和‘达摩中透。绿叶‘达摩叶片全绿；‘达摩冠艺的叶艺在叶缘；‘达摩斑缟艺的叶片从基部到尖端有纵向条纹，以缟线为主，缟纹为辅；‘达摩宝艺的叶片从基部到尖端有纵向条纹，以缟纹为主，缟线为辅；‘达摩中透叶艺多集中在叶柄，叶尾有绿帽（图1）。

用数字和字母表示各品系叶片取样测定部分，其中绿叶‘达摩叶片为1G；‘达摩冠艺叶片绿色区域为2G、黄色区域为2Y；‘达摩斑缟艺叶片绿色区域为3G、黄色区域为3Y；‘达摩宝艺叶片绿色区域为4G、黄色区域为4Y；‘达摩中透叶片绿色区域为5G、黄色区域为5Y。

1.2 方法

1.2.1 光合色素含量测定 用ddH2O清洗除去杂物，室温晾干，避开主脉部分分别剪取绿叶‘达摩和4个‘达摩叶艺品系叶片中的黄色区域和绿色区域，测定方法参考许元明等[8]采用的分光光度法。

1.2.2 叶绿素荧光参数的测定 测定时间在2016年6月，于上午9 ： 00～11 ： 00在室内采用MINI-PAM-Ⅱ（WALZ，德国）超便携式调制叶绿素荧光仪不离体测定绿叶‘达摩和4个‘达摩叶艺品系叶片黄色区域和绿色区域的叶绿素荧光参数PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、PSⅡ实际光化学效率Y（Ⅱ）、光化学淬灭系数（qp）和非光化学淬灭系数（NPQ），其中Y（Ⅱ）、qp、NPQ值直接在室温下进行测定，Fv/Fm值在叶片经过至少20 min黑暗处理后于室温下测定；对照：0天时待样品经过暗适应后进行测定。各项测定均重复3次，操作方法参照仪器使用说明书。

1.2.3 叶绿体电镜样品的制备及观察 将绿叶‘达摩绿色叶片和4个‘达摩叶艺品系的黄色区域和绿色区域叶片分别切成1 mm宽的长条，用2.5%戊二醛于4 ℃固定4 h；用PBS缓冲液漂洗3次，每次10 min；用1%锇酸处理后固定2 h，再用乙醇系列梯度脱水；用Epon812环氧树脂包埋，分别于37、45、65 ℃温箱固化24 h；采用UltracutE超薄切片机切片和醋酸双氧铀硝酸铅染色；最后用JEM-1200EX透射电镜观察。

1.3 数据分析

用SPSS19.0统计软件进行数据方差分析，用EXCEL进行数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 绿叶‘达摩与叶艺品系光合色素含量的差异

叶绿素含量测定结果表明，墨兰‘达摩叶艺品系叶片黄色区域的总叶绿素含量和类胡萝卜素含量均显著低于绿色区域（表1）。相比于正常绿叶，4个变异品系中除‘达摩斑缟艺外，其余3个品系绿色区域的总叶绿素和类胡萝卜素含量均低于绿叶‘达摩；4个变异品系黄色区域光合色素含量降低十分显著，其中总叶绿素含量分别为绿叶‘达摩的4.57%、11.29%、6.02%和0.87%，类胡萝卜素含量分别为6.49%、13.92%、7.39%和1.63%。

叶艺品系黄色区域的Caro/Chl值均大于绿色区域，说明其叶片黄化是由总叶绿素含量降低造成的。‘达摩冠艺、‘达摩斑缟艺和‘达摩宝艺黄色区域的Chla/Chlb值均大于绿色区域，说明叶绿素b缺乏是其叶片黄化主因。而‘达摩中透黄色区域的Chla/Chlb值小于绿色区域，说明叶绿素a缺乏是其叶片黄化主因。

2.2 绿叶‘达摩与叶艺品系的主要荧光参数的差异

通过测定5个‘达摩品系的叶绿素荧光参数，发现叶艺品系黄色区域的叶片光系统Ⅱ原初光能转化效率（Fv/Fm值）[9]均小于绿色区域，说明黄色区域光合结构受到了破坏，光化学能力下降。除黄色区域的Fv/Fm值降低外，叶艺品系绿色区域的Fv/Fm值均小于绿叶‘达摩，且‘达摩中透、‘达摩冠艺、‘达摩宝艺、‘达摩斑缟艺依次降低，与其叶绿素含量变化趋势一致（图2）。

实际光化学效率Y（Ⅱ）参数测定结果表明叶艺品系绿色区域的Y（Ⅱ）值同样都小于绿叶‘达摩。值得一提的是，除‘达摩斑缟艺外，‘达摩冠艺、‘达摩宝艺和‘达摩中透叶片黄色区域的Y（Ⅱ）值均大于绿色区域，且其qp的变化趋势也与Y（Ⅱ）一致。Y（Ⅱ）反映实际光化学量子产量，较高的Y（Ⅱ）值说明光能转化效率高，利于合成更多的ATP和NADPH[10]。qp反映PSⅡ反应中心开放部分的比例，开放比例高，电子传递能力越强[11]。变异品系黄色区域较高的Y（Ⅱ）和qp值可能与其高比例的叶绿素a和类胡萝卜素含量相关。

NPQ反映PSⅡ天线色素吸收的光能以热的形式耗散的份额。NPQ参数测定结果表明叶艺品系绿色区域的NPQ值均高于黄色区域，说明绿色区域捕获的激发能中有部分没有被光化学反应利用，而是通过热能形式耗散過剩的光能，在一定程度上保护光合结构。‘达摩冠艺、‘达摩中透、‘达摩斑缟艺和‘达摩宝艺绿色区的NPQ值依次低于绿叶‘达摩，说明绿叶‘达摩PSⅡ反应中心的热耗散效率最高。

2.3 绿叶‘达摩与叶艺品系叶绿体超微结构的比较

叶片超薄切片的超微结构和透射电镜分析表明（表2、图3），绿叶‘达摩和4个叶艺品系叶片绿色区域的叶绿体外膜清晰且完整，基粒片层排列基本有序，基质浓厚。叶绿体发育完整程度按‘达摩中透、‘达摩冠艺、 ‘达摩宝艺、‘达摩斑缟艺的顺序依次降低，且均低于绿叶‘达摩。

黄色区域叶绿体外膜在不同程度上发生破损，叶绿体体积明显小于绿色区域，其发育成熟程度也均低于绿色区域，基粒片层断裂，排列散乱无序，基质淡薄，嗜锇颗粒含量增加。叶绿体发育完整程度按‘达摩宝艺、‘达摩中透、‘达摩冠艺、‘达摩斑缟艺的顺序依次减低。

3 讨论

李玮等[12]在对芥菜型油菜自发黄化突变体L638-y进行研究时发现，突变体中的总叶绿素含量明显减低，且叶绿素a的降幅小于叶绿素b。本研究中‘达摩叶艺品系叶片黄色区域中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量均大幅减少，总叶绿素含量减少导致叶片黄化。范艳萍等[13]在研究墨兰花叶线艺兰叶色色斑形成的原因中发现，3个花叶线艺兰品种叶片黄色部分的类胡箩卜素含量均低于绿色部分，但类胡箩卜素含量与总叶绿素含量的比值则大于绿色部分，这与本研究对4个‘达摩叶艺品系的测定结果相类似。‘达摩冠艺、‘达摩斑缟艺和‘达摩宝艺叶艺品系黄色区域的Chla/Chlb值大于绿色区域，但‘达摩中透则相反，说明‘达摩中透的叶绿素合成代谢途径可能不同于其它3个叶艺品系。

植物叶片叶绿素荧光动力学参数与光合色素含量密切相关，且与光合作用过程有紧密联系，已经被广泛应用到植物光合机理和逆境生理研究的领域中[14-17]。叶绿素含量降低往往伴随着叶绿体结构的异常[18]，叶绿体发育缺陷会影响叶绿素等光合色素的稳定性，从而改变各种色素的含量及比例，导致叶色变异[19]。橄榄型油菜[20]、水稻[21]的叶艺品种中叶绿体嗜锇颗粒含量多，基粒发育不良，发育程度较低。本研究发现墨兰‘达摩叶艺品系黄色区域的叶绿体均发生了不同程度的破损，嗜锇颗粒数量增加，片层断裂呈无序状排列。不同品系间绿色区域叶绿体发育程度也存在较大差异。根据植物种类的不同Fv/Fm值也有所差异，一些植物种类黄色区域的Fv/Fm值高于绿色区域，但也有一些植物接近或低于绿色区域[22-24]。本研究发现，‘达摩叶艺品系绿色区域Fv/Fm值均大于黄色区域，且变化趋势与各品系绿色区域叶绿体显微结构的分析结果较一致；绿色区域的Y（Ⅱ）值、qp值与其叶绿素含量和类胡萝卜素含量变化趋势一致。绿叶‘达摩的总叶绿素含量和类胡萝卜素含量低于‘达摩斑缟艺，但其Y（Ⅱ）值高于‘达摩斑缟艺，这可能与绿叶‘达摩叶片中叶绿体发育成熟程度较高有关。类胡萝卜素是辅助捕光色素，其相对含量的增多扩大了吸收光的范围。‘达摩冠艺、‘达摩宝艺和‘达摩中透叶片黄色区域的Y（Ⅱ）高于绿色区域，可能是由于其类胡萝卜素相对含量的增多造成的。然而，‘达摩斑缟艺黄色区域的Y（Ⅱ）却低于绿色区域，说明黄色区域Y（Ⅱ）值的大小除了与类胡萝卜素有关外，还与叶绿体的发育成熟程度等有关。

参考文献

[1] 潘瑞炽， 董愚得. 植物生理学[M]. 第3版. 北京： 高等教育出版社， 1995： 17-18.

[2] 何 冰， 刘玲珑， 张文伟， 等. 植物叶色突变体[J]. 植物生理学通讯， 2006， 42（1）： 1-9.

[3] 颜学亮， 何清正， 刘清涌. 中国墨兰[M]. 广州： 广东科技出版社， 2001： 209-215.

[4] 李炳宏， 李勇毅， 石庆丰. 千禧兰香[M]. 台北： 橘子整合行销有限公司， 2001： 14-87.

[5] 朱根发， 李冬梅， 郭振飞. 中国墨兰品种遗传多样性的AFLP分析[J]. 中山大学学报（自然科学版）， 2009， 48（3）： 69-73.

[6] 李冬梅， 朱根发， 叶庆生. 墨兰 “达摩” 芽变叶艺品种亲缘关系的RAPD分析[J]. 热带作物学报， 2007， 28（3）： 74-77.

[7] Zhu G， Yang F， Shi S， et al. Transcriptome characterization of Cymbidium sinense ‘Dharma using 454 pyrosequencing and its application in the identification of genes associated with leaf color variation[J]. Plos One， 2015， 10（6）： e0128592.

[8] 许元明， 韦友欢， 曾加源. 三种植物叶片类胡萝卜素含量的比较分析[J]. 广西民族师范学院学报， 2013， 30（3）： 18-19.

[9] Rohacek K， Bartak M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence： basic concepts， useful parameters， and some applicadons[J]. Photosynthetlea， 1999， 37（3）： 339-363.

[10] 陶文文， 蒋文伟， 赵丽娟. 3 个钓钟柳品种叶绿素荧光特性比较[J]. 浙江农林大学学报， 2011， 28（3）： 367-371.

[11] 张其德， 卢从明， 冯丽洁， 等. CO2加富對紫花苜蓿光合作用原初光能转换的影响[J]. 植物学报， 1996（38）： 77-82.

[12] 李 玮， 于澄宇， 胡胜武. 芥菜型油菜叶片黄化突变体的初步研究[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2007， 35（9）： 79-82.

[13] 范燕萍， 李慧玲， 李浩建. 几种花叶线艺兰叶片色斑色素组成和叶绿体超微结构研究[J]. 华南农业大学学报， 2006， 27（2）： 8-12.

[14] 刘梦洋， 卢 银， 赵建军， 等. 大白菜叶色突变体的HRM鉴定及其叶绿素荧光参数分析[J]. 园艺学报， 2014， 41（11）： 2 215-2 224.

[15] 邵 勤， 于泽源， 李兴国， 等. 叶色黄化突变体甜瓜叶片内部生理生化变化的研究[J]. 中国蔬菜， 2013（14）： 59-65.

[16] 莫亿伟， 郭振飞， 谢江辉. 温度胁迫对柱花草叶绿素荧光参数和光合速率的影响[J]. 草业学报， 2011， 20（1）： 96-101.

[17] 陈 辰， 刘桂华， 赵海燕， 等. 华东楠叶绿素的荧光特性[J]. 东北林业大学学报， 2011， 39（10）： 50-53.

[18] 华 春， 王仁雷. 盐胁迫对水稻叶片光合效率和叶绿体超显微结构的影响[J]. 山东农业大学学报（自然科学版）， 2004， 35（1）： 27-31.

[19] Chen G， Bi Y R， Li N. EGY1 encodes a membrane-associated and ATP-dependent metalloprotease that is required for chloroplast development[J]. The Plant Journal， 2005， 41（3）： 364-375.

[20] 董 遵， 劉敬阳， 马红梅， 等. 甘蓝型油菜黄化（苗）突变体的叶绿素含量及超微结构[J]. 中国油料作物学报， 2000， 22（3）： 27-34.

[21] 吴殿星， 舒庆尧， 夏英武， 等. 60Co-γ射线诱发水稻温度调控叶色白化突变基因表达突变系[J]. 中国农业科学， 1997，30（3）： 95-95.

[22] 谭新星， 许大全， 汤泽生. 叶绿素缺乏的大麦突变体的光合作用和叶绿素荧光[J]. 植物生理学报， 1996， 22（1）： 51-57.

[23] Xu D Q， Chen X M， Zhang L X， et al. Leaf Photosynthesis and chlorophyll fluorescence in a chlorophyll-deficient soybean mutant[J]. Photosynthetica， 1993， 29（1）： 103-112.

[24] Lokstein H， Hartel H， Hoffmann P， et al. Comparison of chlorophyll fluorescence quenching in leaves of wild-type with a chlorophyll-b-less mutant of barley（Hordeum vulgare L.）[J]. J Photochem of Photobiol B： Biol， 1993， 19（3）： 217-225.