黑蜂蜂胶免疫活性和体内抗肿瘤研究

孙小英 邹玉 王涛 王魁源 罗志文

摘要[目的]觀察东北黑蜂蜂胶醇提取物对昆明鼠免疫活性的影响和肿瘤抑制率。[方法]通过动物体内试验，制备H22模型小鼠，计算黑蜂蜂胶提取物肿瘤抑制率，测定单核-巨噬细胞碳廓清的吞噬指数。[结果]东北黑蜂蜂胶醇提取物各组的吞噬指数、瘤重与阴性对照组比较，具有统计学意义（P<0.05），说明东北黑蜂蜂胶醇提取物能够提高H22小鼠的免疫活性，对肿瘤的生长在一定程度上有很强的抑制作用，东北黑蜂蜂胶的乙醇提取物抗肿瘤作用显著。[结论]该研究为蜂产品进一步走向医疗领域特别是治疗癌症提供理论支持。

关键词东北黑蜂；蜂胶醇提取物；昆明小鼠；免疫活性；抗肿瘤

中图分类号R282.74文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0127-02

Study on Immune Activity and Antitumor Activity of Apis mellifera Propolis

SUN Xiaoying，ZOU Yu，WANG Tao，LI Chunfeng* et al

（College of Life Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective] The research aimed to observe the effect of alcohol extract of northeast Apis mellifera propolis on immune activity and tumor inhibition rate of Kunming mice.[Method] H22 model mice were prepared by in vivo animal test. The tumor inhibition rate of Apis mellifera propolis extract was calculated and the phagocytic index of mononuclear macrophages was measured.[Result] The phagocytic index and tumor weight of the

Apis mellifera propolis extract were significantly higher than those of the negative control group （P<0.05），which indicated that the extract of northeastern Apis mellifera propolis could improve the immunological activity of H22 mice and had a strong inhibitory effect on the growth of tumor. The ethanol extract of northeastern Apis mellifera propolis had significant antitumor effect.[Conclusion] The study provides theoretical support for the further development of bee products in the medical field， especially in the treatment of cancer.

Key wordsApis mellifera；Alcohol extract of propolis；Kunming mice；Immunological activity；Antitumor

東北黑蜂（Apis mellifera ssp.）是俄罗斯蜂和卡尼鄂拉蜂的中间过渡，并在一定意义上混有意大利蜂和高加索蜂这二者之血统，经长期自然选择结合人工选择而形成的一个新的品种，分布在我国黑龙江省，比其他普通蜜蜂个体大，全身呈现黑色，具有很强大的生命力，抗菌抗寒能力均优于其他蜂[1-2]，并且其蜜源植物是大面积的原始林，这使得它能够提供优质的蜂产品。

蜂胶（Propolis）是蜜蜂从适宜植物的芽孢、受损树干上采集的半固体混合物类似松脂状物质，以及花粉等再加入自身上腭腺所分泌的物质混合加工而成的一种带有芳香味感的黏稠的胶状固体，这一蜂产品是蜂群修理蜂房、防御疾病和侵害性微生物的一种蜂群特有的药物，对蜂巢内部起到了杀菌消炎作用的一种特性[3]，具有消炎、抗氧化、抗菌、提高免疫、抗肿瘤作用。笔者运用东北黑蜂蜂胶的提取物进行试验研究，分析黑蜂蜂胶的提取物对H22小鼠免疫活性的影响及其抗肿瘤作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物。昆明种系小鼠，雌雄小鼠各半，体重18～22 g。正常饲养，自由进食和喂水，光照12 h/d。大约7 d左右适应新环境，经过仔细观察，将健康的小鼠进行分组。

1.1.2肿瘤细胞株。H22肿瘤细胞株，经小鼠腹腔传代保种，由佳木斯大学中心实验室提供。

1.1.3试验仪器。分光光度计；RE-52AA旋转蒸发器；YP600电子天平；电热恒温鼓风干燥箱；循环水式真空泵；恒温水浴锅；WND-200型高速中药粉碎机；离心机；微量注射器。

1.1.4试验药品。蜂胶购自虎林市黑蜂蜜蜂园；芦丁标准液；环磷酰胺，国药准字H22022673，通化茂祥制药有限公司；印度墨汁。

1.2方法

1.2.1黑蜂蜂胶的提取。

1.2.1.1预处理。称取500 g东北黑蜂毛胶，放入冰箱，在-20 ℃冷冻3 h，取出粉碎过20目标准筛，用水浴的方式除去蜂蜡。将粉碎后的蜂胶粉倒入烧杯中，再加12倍体积量蒸馏水，在75 ℃浸泡40 min，并搅拌，蜂蜡缓缓析出，将烧杯静置冷却至室温隔夜之后，把上层已凝固了的蜂蜡小心取走。将去除蜂蜡的蜂胶，在0 ℃条件下冷冻4 h以上，再进行粉碎。粉碎过程要控制温度，防止蜂胶在高温下融化影响粉碎效果，过20目筛待提取。

1.2.1.2醇提法。分別称预处理好的蜂胶3份，5 g/份；分放在烧杯中，分别加入10倍量的40%、80%、90%乙醇，冷浸2 d[4-6]，分别在30 ℃恒温水浴中加热并搅拌 30、45、60 min过滤，留滤液。重复上述试验3次，然后把滤液倒一起，于30 ℃下用真空旋转蒸发器将滤液浓缩到一定体积，配制蜂胶溶液低、中、高浓度分别是1.0%、1.5%、2.5%，4 ℃保存备用。

1.2.2模型制备。

昆明小鼠，3～4周龄，体重（19±3）g，自由进食物和水。从预先培养的荷瘤小鼠腹腔中抽出H22细胞，用无菌生理盐水稀释10倍，摇匀后，取此细胞液加台盼蓝染色，计数，细胞存活率在95%以上。将H22细胞悬液02 mL采用无菌方法接种到正常小鼠腹腔内，每只小鼠注射0.1 mL（细胞数为2×107个/mL）培养。腹腔传代2次，从培养的荷瘤小鼠腹腔中抽取含有H22的腹水，用无菌生理盐水加肝素钠稀释10倍。将H22细胞悬液吸取0.2 mL接种在试验小鼠的右前肢腋下，制备移植瘤模型小鼠。

1.2.3黑蜂蜂胶醇提取物对小鼠免疫活性的影响。

1.2.3.1免疫活性试验。接种7 d后，取25只小鼠分组，将小鼠称重，分为阴性组、黄酮组、阳性对照组，其中黄酮组又分为高、中、低3个组（共5组，每组5只）。阴性对照组，每天按0.01 mL/（g·只）的量给予0.9%生理盐，每天1次，连续7 d；

黄酮组为高、中、低3个组，按0.01 mL/（g·只）的量，以高、中、低3个浓度给药但体积相同，每天1次，连续7 d；阳性对照组按20 mg/（kg·只）给药环磷酰胺生理盐水，每天1次，连续7 d。

1.2.3.2小鼠碳廓清试验。末次用药24 h后，用徒手固定法，需2个人进行。第1步固定：用毛巾按住小鼠同时露出尾巴，把小鼠固定好，尾巴拉直，用酒精棉球不断擦尾巴，受热使尾部静脉受热扩张，不断重复动作，到看清血管为止。用食指、中指、无名指、大拇指将小鼠尾巴固定。第2步注射：用1 mL 注射器，握住其靠前0.1 mL处；推针姿势：右手小指摁左手拇指然后进针。注射时左手扯住尾巴，使尾巴紧紧贴在桌面上，一般选择距尾尖1/4或1/3处进针，以0.01 mL/g体重的剂量，给小鼠尾静脉注射印度墨汁生理盐水，挑皮肤薄及血管清晰处进针。注意观察是否有回血与人静脉点滴相似，有回血就开始注射。注射印度墨汁结束后，使用医疗用棉花止血。取血时间分别是在2、10 min；方法是把吸管用肝素处理，在内眦静脉丛取血20 μL，马上溶于到2 mL 的0.1% Na2CO3溶液中并轻轻摇匀，用722分光光度计于600 nm测吸光度（A），以Na2CO3溶液作为空白，然后拉颈处死，解剖取出肝和脾，用滤纸轻轻把表面血污吸干，分别称重（g），计算廓清指数K值和校正吞噬指数α值。

K=（lgA1-lgA2）/（T2-T1）

α=K1/3·体重/ （肝重+脾重）

式中，a為吞噬指数；K为廓清指数；A1是T1时的吸光度；A2是T2时的吸光度；T1是给墨汁后第1次取血的时间；T2是给墨汁后第2次取血的时间。

1.2.4黑蜂蜂胶醇提取物抑制肿瘤生长试验。分组及给药方法与“1.2.3.1”方法相同。

最后一次施药24 h以后，断颈处死，称量体重并剥离瘤块称重，计算抑瘤率，抑瘤率=（阴性对照组瘤重-试验组瘤重）/阴性对照组瘤重×100%。

2结果与分析

2.1黑蜂蜂胶醇提物对小鼠的单核巨噬细胞碳廓清功能的影响由表1可知，

黑蜂蜂胶组和阳性对照组的吞噬指数均大于阴性对照组，并且各试验组与阴性对照组的差异均表现出显著性（P<0.05），说明黑蜂蜂胶醇提物具有促进移植瘤小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用，表明黑蜂蜂胶醇提物能提高H22的免疫活性。

2.2黑蜂蜂胶醇提取物对小鼠移植瘤生长的影响由表2

可知，蜂胶低、中、高3个浓度组瘤均明显小于阴性对照组；高浓度组

抑瘤率大于低浓度组和中浓度组；从各浓度组可以看出，蜂胶抑制肿瘤的作用对剂量存在一定的依赖性；高浓度组与对照组比较有显著性差异（P<0.05），表明东北黑蜂蜂胶醇提物对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用，说明黑蜂蜂胶具有很客观的抗癌作用。由于蜂胶是一种纯天然、无副作用的纯天然药物，具有广阔的研发前景和市场价值，为蜂产品进一步走向医疗领域特别是治疗癌症这一领域提供理论支持。

3小结与讨论

该试验结果表明，黑蜂蜂胶有提高H22小鼠免疫活性的能力。蜂胶提取物还能将免疫功能低下的病态鼠的自身免疫功能恢复甚至达到正常水平；蜂胶还具有抗菌、抗病毒、调节血糖、抗氧化、抗癌、抗炎、镇痛、降血脂、抗溃疡、保肝、抗疲劳、促进组织再生等作用。由此可见，蜂胶作为保健品的研制与开发有着巨大的市场潜力[7-9]。

肿瘤传统疗法以手术加放疗和化疗配合为主，这的确能除去大部分的癌细胞，但同时附带的副作用和对身体免疫功能的破坏是明显的。以环磷酰胺这一老牌的抗肿瘤药物作为对比，此次试验过程中的黑蜂蜂胶醇提物同样表现出很强的抑瘤作用，但用传统疗法会使移植瘤鼠的体重下降、饮食、精神都很糟糕，且明显是免疫功能的下降，而使用黑蜂蜂胶醇提物却不存在这些副作用。大量的试验研究表明，蜂胶提取物具有显著的抗肿瘤和调节机体免疫功能的作用。因此，此次试验观察黑蜂蜂胶醇提物对H22移植瘤在小鼠体内的生长情况及它对荷瘤小鼠免疫活性的影响，结果发现，黑蜂蜂胶醇提物高剂量组能明显地减缓小鼠的体内肿瘤生长，说明黑蜂蜂胶醇提物能抑制肿瘤细胞增殖，对防治肿瘤生长有积极意义。

参考文献

[1]

刘胜范，王树壮.东北黑蜂演化史概述[J].蜜蜂杂志，2016，36（4）：7-9.

[2] 彭文君，罗其花，李长春，等.基于微卫星标记的东北黑蜂群体遗传多态性分析[J].中国农业，2012，45（21）：4484-4491.

[3] 周剑虹.蜂胶将成为天然保健品开发新热点[J].医学信息，1997（6）：15-16.

[4] 叶陆星，胡福良，玄红专.蜂胶的提取方法及影响因素[J].蜜蜂杂志，2002（7）：16-17.

[5] 丁立新，张楠楠，张云杰，等.桂花中黄酮类物质提取与纯化的研究[J].黑龙江医药科学，2008，31（5）：23，24.

[6] 张杰，焦淑清，滕杨，等.樱桃叶中总黄酮的提取工艺研究[J].黑龙江医药科学，2010，33（2）：13，14.

[7] 潘明.蜂胶提取物对荷瘤小鼠肿瘤免疫系统的影响研究[J].时珍国医国药，2007，18（2）：415-416.

[8] 刘进祖.保健食品新热点——蜂胶[J].绿化与生活，1999（3）：17-18.

[9] ORSOLIC′ N，KNEZEVIC′ A H，SVER L，et al.Immunomodulatory and antimetastatic action of propolis and related polyphenolic compounds[J]. Journal of ethnopharmacology，2004，94（2/3）：307-315.