草鱼模拟肠液的开发及其在仿生消化仪上的应用

温伟辛 徐树德 胡毅

摘要[目的]研制草鱼模拟肠液配方。[方法]根据草鱼成鱼的肠道淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，pH以及钠离子环境，研制了一套草鱼成鱼的模拟肠液配方，并研究其在仿生消化仪上的应用。[结果]利用配制的草鱼模拟肠液进行体外仿生消化试验，发现饲料中干物质和粗蛋白的消化率与真实值的绝对差值均在10%左右，达到仿生消化的目的与要求。此外，经过仿生消化，外源植酸酶能够显著提高干物质消化率、粗蛋白消化率和代谢能值，促进植酸磷的释放。[结论]该研究结果可为草鱼的体外模拟消化提供更可靠的试验数据，并为水产其他动物模拟肠液的开发提供参考。

关键词草鱼；仿生消化仪；模拟肠液；营养物质消化率；代谢能值

中图分类号S931文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0110-03

Development of Simulated Intestinal Fluid of Ctenopharyngodon idellus and Its Application in Simulated Digesting Apparatus

WEN Weixin1，XU Shude1，2，HU Yi1

（1.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；2.Fisheries College of Ocean University of China/ Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feeds，Ministry of Agriculture/ Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Qingdao，Shandong 266003）

Abstract[Objective] To develop the formula of simulated intestinal fluid of Ctenopharyngodon idellus.[Method] According to the activities of amylase，trypsin and chymotrypsin，pH and sodium ion environment in the intestines of C.idellus adult，a formula of simulated intestinal fluid for C.idellus adult was developed.And its application in simulated digesting apparatus was studied.[Result] Through in vitro simulated digestion experiment of prepared simulated intestinal fluid of C.idellus，it was found that the absolute difference between the digestibility of dry matter and crude protein in feed and true values were about 10%，which met the purpose and requirements of simulated digestion.In addition，after the simulated digestion，exogenous phytase could significantly increase dry matter digestibility，crude protein digestibility and metabolic energy，and promote the release of phytate.[Conclusion] The research results can provide more reliable experimental data for in vitro simulation and digestion of C.idellus and provide references for the development of simulated intestinal fluid in other aquatic animals.

Key wordsCtenopharyngodon idellus；Simulated digesting apparatus；Simulated intestinal fluid；Digestibility of nutrient；Metabolizable energy value

自20世紀60年代以来，为了开发对饲料养分生物学效价的快速评定技术，各国学者在离体法、原位法以及生物学法的简化方面进行了大量研究。20世纪90年代中期，欧洲国家以三角瓶为模拟消化器，采用以胃蛋白酶、胰液素为模拟消化液酶液的体外法测定猪饲料的消化能值。但是，上述方法有诸多因素容易导致系统误差，如饲料粉碎粒度、消化酶与样品的比例、缓冲液pH、酶促反应温度、水解時间、未消化残渣的分离、残渣过滤后脂肪在滤纸中的残留等[1-2]。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所开发的仿生消化仪，近几年在国内大型饲料企业和添加剂公司得到了应用与推广。目前，仿生消化仪主要应用在畜禽上[1，3]，而仿生消化仪在水产动物上的应用报道较少。

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国重要的淡水养殖经济鱼类之一，其食性随着草鱼的生长发育而改变，能利用植物性和动物性2类饵料[4-5]。市场上草鱼饲料种类繁多，而草鱼对不同饲料的利用率、添加酶制剂是否能够促进草鱼对饲料中营养物质的消化和吸收都有待进一步研究。笔者利用常规生化方法对草鱼肠液进行模拟，开发了一套草鱼模拟肠液配方，并在仿生消化仪上进行了应用，旨在为草鱼的体外模拟消化提供更可靠的试验数据，也为其他水产动物模拟肠液的开发提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1取样。2013年9月7日在珠海斗门白蕉某草鱼养殖池塘进行取样，投喂饲料30 min内立即随机挑选8尾草鱼，平均体重1.9 kg，平均体长43.4 cm。称重、测量体长后迅速进行解剖，取其肠组织，液氮中运输并保存在-65 ℃超低温冰箱中，备用。

1.1.2样品处理。

1.1.2.1肠黏液上清的制备。

于冰盘内剔除肠周围残余脂肪，剪开肠道，分别收集前肠、后肠内黏液，再用预冷生理盐水冲去内容物，用滤纸轻轻擦干，称量前肠重、后肠重。使用pH计分别测定前肠、后肠黏液以及食糜的pH。肠黏液在4 ℃、11 000 r/min条件下离心20 min后，取上清1 mL，加入预冷的生理盐水，稀释至10 mL，24 h内测定其淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性。

1.1.2.2肠组织粗酶液的制备。

取前肠、后肠各1 g，加入9倍质量的预冷生理盐水，用高速匀浆机进行匀浆，倒入10 mL的离心管中，4 ℃、11 000 r/min条件下离心20 min，24 h内测定其主要消化酶活性。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂。福林-酚试剂（4 ℃下保存）、0.55 mol/L碳酸钠溶液、10%三氯乙酸溶液、0.20 mol/L磷酸缓冲液、0.5%干酪素溶液、100 μg/mL酪氨酸溶液（4 ℃下保存）、盐酸、氯化钠、无水乙醇、植酸酶、淀粉酶[型号A3306，购自Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司]、胰蛋白酶（型号0785，购自美国Amresco股份有限公司）、糜蛋白酶（型号0164，购自美国Amresco股份有限公司）、淀粉酶测试盒、糜蛋白酶测试盒（南京建成生物科技有限公司）以及Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2.2主要仪器。SDS-2仿生消化仪、岛津UV-1800分光光度计、低温离心机、恒温水浴锅、分析天平、pH计、匀浆器、干燥器以及滴定管等。

1.3方法

1.3.1肠黏液和组织中淀粉酶活力的测定。使用淀粉酶测试盒，测定肠黏液和组织中淀粉酶活力。①肠黏液淀粉酶活力。取100 mL肠黏液上清，在25 ℃、pH 7.05条件下与底物作用30 min，水解10 mg淀粉为1个酶活单位。按照以下公式计算肠黏液中淀粉酶活力：

淀粉酶活力（U/mL）=（空白OD值-测定OD值）/空白OD值×80×稀释倍数。②肠组织中淀粉酶活力。肠组织中每毫克蛋白在25 ℃、pH 7.05条件下与底物作用30 min，水解10 mg淀粉为1个酶活单位。按照以下公式计算肠组织中淀粉酶活力：淀粉酶活力（U/mg prot）=（空白OD值-测定OD值）/空白OD值×08/待测样本蛋白浓度。

1.3.2肠黏液和组织中胰蛋白酶活力的测定。

各试管中加入0.5%酪素2 mL，于37 ℃水浴中反应15 min，然后加入10%三氯乙酸3 mL，经过滤除去沉淀，取清液1 mL，加入055 mol/L碳酸钠溶液5 mL，再加入福林试剂1 mL，于37 ℃水浴中显色15 min，测定OD680值。以光密度为纵坐标，以酪氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。①肠黏液中胰蛋白酶活力。每毫升肠黏液上清在25 ℃、pH 7.05条件下每分钟分解干酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位。按照以下公式计算肠黏液中胰蛋白酶活力：胰蛋白酶活力（U/mL）=（生成的酪氨酸质量/15）×酶液稀释倍数。②肠组织中胰蛋白酶活力。每毫克肠組织蛋白在25 ℃、pH 7.05条件下每分钟分解干酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位。按照以下公式计算肠组织中胰蛋白酶活力：胰蛋白酶活力（U/mg prot）=（生成的酪氨酸质量/15）/待测样本蛋白浓度×加样体积。

1.3.3肠黏液和组织中糜蛋白酶活力的测定。使用糜蛋白酶测试盒，测定肠黏液和组织中糜蛋白酶活力。

①肠黏液中糜蛋白酶活力。每毫升肠黏液上清在25 ℃、pH 7.05条件下每分钟分解蛋白生成1 μg氨基酸相当于1个酶活力单位。按照以下公式计算肠黏液中糜蛋白酶活力：糜蛋白酶活力（U/mL） = （测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度/（10×0.64/0.04）×10。②肠组织中糜蛋白酶活力。每毫克肠组织蛋白在25 ℃、pH 7.05条件下每分钟分解蛋白生成1 μg氨基酸相当于1个酶活力单位。按照以下公式计算肠组织中糜蛋白酶活力：糜蛋白酶活力（U/mg prot）= （测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度/（10×0.64/0.04）/待测样本蛋白浓度。

1.3.4前肠、后肠黏液中Na+浓度的测定。

采用酸碱滴定法滴定肠液中Na2HPO4和NaH2PO4浓度来反映Na+浓度。用NaOH准确滴定H2PO4-，用酚酞作为指示剂，滴定终点由无色变为微蓝色。由于Na2HPO4的Ka3很小，不能直接连续滴定，用盐酸滴定HPO42-，用甲基橙作为指示剂，终点时溶液由红色变为黄色。

1.3.5草魚模拟肠液在仿生消化仪上的应用。

根据测定肠液中的酶活力、pH以及Na+浓度，以SDS-2仿生消化仪及相关技术为依托，配制基于该仿生消化仪的草鱼模拟肠液。按照该系统操作规程（略有改进），对配制的草鱼模拟肠液进行一系列仿生消化试验。

1.3.5.1草鱼幼鱼、成鱼饲料的仿生消化评估。分2批进行试验，试验均在仿生消化仪上进行。试验1分为2组，每组5个重复，第1组为A公司草鱼成鱼沉水料638（粗蛋白含量22%），第2组为A公司草鱼成鱼膨化料6636（粗蛋白含量26%）。试验2同样分为2组，每组5个重复，第1组为B公司草鱼幼鱼沉水料，第2组为B公司草鱼幼鱼膨化料。2批试验均利用配制的模拟肠液分别对草鱼幼鱼和成鱼饲料进行模拟消化。仿生消化仪的酶液反应温度设为25 ℃。

1.3.5.2外源酶制剂 （植酸酶）对饲料消化利用率的影响。

试验分为2组，每组5个重复，第1组为对照组，第2组为加酶组，在对照组的基础上添加300 g/t的植酸酶（2 000 U/g，粉剂）。利用仿生消化仪评估外源植酸酶对A公司草鱼成鱼颗粒料639（粗蛋白含量25%）中营养物质消化利用率的影响。

1.4数据处理试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析（ANOVA），P<0.05表示差异显著；采用Duncans方法进行多重比较分析。试验结果均以平均值±标准误表示。

2结果与分析

2.1草鱼人工模拟肠液配方试验结果表明，草鱼前肠、后肠淀粉酶和糜蛋白酶活性均无显著差异，但前肠胰蛋白酶活性显著高于后肠胰蛋白酶活性（P<0.05）。

通过对草鱼肠液进行人工模拟，得到草鱼模拟肠液的配方：分别称取淀粉酶152.025 kU、胰蛋白酶45.959 kU以及糜蛋白酶12.893 kU，将三者溶解于250 mL去离子水中，缓慢搅拌直至完全溶解（勿在加热板上加热）。进行仿生试验时，透析袋中模拟肠液的总体积为20 mL，若需添加外源酶，按酶的推荐添加量折算成体积2 mL进行添加。

2.2草鱼人工模拟肠液的pH

使用pH计分别测定草鱼前肠黏液、后肠黏液的pH，结果表明前肠黏液pH为6.95，后肠黏液pH为6.92。前肠、后肠食糜的平均pH为7.05，为肠道消化酶反应时的pH环境，因此该试验中肠道消化酶测定时pH均为7.05。

2.3草鱼模拟肠液中的Na+浓度

2.3.1肠黏液中磷酸二氢钠的浓度。

通过滴定发现，磷酸二氢钠在前肠和后肠黏液中的浓度分别为0.187和0.199 mol/L。因此，在配制仿生消化试验磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液时，前肠、后肠分别称取无水磷酸二氢钠44.89和47.76 g，定容至2 000 mL容量瓶中，25 ℃条件下调节溶液pH至6.95。

2.3.2肠黏液中磷酸氢二钠的浓度。

通过滴定发现，磷酸氢二钠在前肠和后肠黏液中的浓度分别为0.357和0.352 mol/L。因此，在配制仿生消化试验磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液时，前肠、后肠分别称取无水磷酸氢二钠10148和100.06 g，定容至2 000 mL容量瓶中，25 ℃条件下调节溶液pH至6.92。

2.4草鱼模拟肠液在仿生消化仪上的应用

2.4.1草鱼模拟肠液对草鱼幼鱼、成鱼沉水料和膨化料的仿生消化试验。

模拟肠液对A公司的2种草鱼成鱼饲料和B公司的2种草鱼幼鱼饲料中干物质、粗蛋白消化率和代谢能值的影响分别见表1和表2。由表1、表2可知，A公司草鱼成鱼膨化料6636组干物质消化率、粗蛋白消化率以及代谢能值均显著高于沉水料638组（P<0.05）。A公司草鱼幼鱼膨化料组干物质、粗蛋白消化率及代谢能值也显著高于幼鱼沉水料组（P<0.05）。一般而言，在不同生物学方法条件下饲料代谢能的测定值与“真实值”的差值不低于10%的定量水平[6]。张子仪等[7]研究表明，在不同饲料组合条件下，同一饲料原料鸡代谢能值的绝对差值在10%以上。该研究结果表明干物质和粗蛋白的消化率与真实值的绝对差值均在10%左右，能够达到仿生消化的目的与要求，这说明该研究中草鱼模拟肠液配方能够较好地模拟草鱼肠道消化。

2.4.2外源酶制剂植酸酶对草鱼成鱼沉水料仿生消化的影响。

由表3可知，加酶组干物质、粗蛋白消化率及代谢能值均显著高于对照组（P<0.05），干物质消化率提高了约1%，粗蛋白消化率提高了3.5%，代謝能值提高了1.38 MJ/kg。这表明添加外源植酸酶可以显著提高草鱼成鱼饲料的营养物质利用率。

3结论

（1）笔者对配制的草鱼模拟肠液在仿生消化仪的应用进行了研究，结果表明饲料中干物质和粗蛋白的消化率与真实值的绝对差值均在10%左右，达到仿生消化的目的与要求，说明该草鱼模拟酶液能够用于仿生消化系统的体外模拟消化。

（2）仿生消化试验表明，外源添加植酸酶能够显著提高干物质、粗蛋白消化率以及代谢能值。

（3）通过对商品饲料的仿生消化試验表明，膨化料干物质和粗蛋白的消化率均在70%以上，代谢能值达到（13.97±0.30）MJ/kg，明显高于沉水料，但外源酶制剂是否在沉水料中应用更有效果尚有待深入研究。

参考文献

[1]

BOISEN S，EGGUM B O.Critical evaluation of in vitro methods for estimating digestibility in simplestomach animals[J].Nutrition research reviews，1991，4：141-162.

[2] KIM I B.Development of in vitro technique for bioavailable corn energy value[J].Asianaustrlian journal of animal science，2001，14（11）：1645-1646.

[3] 赵峰.用酶法评定鸭饲料代谢能的方法学研究[D].北京：中国农业科学院，2006：35-47.

[4] 张杏波，梁旭方，朱滔，等.食性对草鱼消化道发育及三种消化酶活性的影响[J].水生生物学报，2012，36（3）：569-572.

[5] 张金梅.草鱼鱼种的食性[J].淡水渔业，1982（6）：41-42.

[6] 赵峰，张宏福，张子仪.基于模拟消化液和开发仿生消化系统评定家禽饲料代谢能值的研究进展[M]//张宏福.饲料营养研究进展，北京：中国农业科学技术出版社，2010：44-55.

[7] 张子仪，吴克谦，吴同礼，等.应用回归分析评定鸡饲料表观代谢能值的研究[J].畜牧兽医学报，1981，12（4）：223-229.