赤水河流域茅台段土壤放线菌的分离?培养?DNA提取

李小霞 桂小薇 肖仲久

摘要[目的]对贵州省赤水河流域茅台段土壤中放线菌进行分离、培养与DNA提取。[方法]从赤水河流域采集土壤样本，采用土壤稀释分离法和划线纯化相结合的方法进行放线菌分离与培养，并对其进行形态学观察。利用CTAB法提取放线菌基因组DNA。[结果]共分离到6株放线菌。0.001 g/mL土壤悬液最适宜分离放线菌。提取的放线菌DNA条带完整，大小约为23.13 kb。[结论]该研究结果可为放线菌的进一步开发利用提供试验材料和理论依据。

关键词放线菌；赤水河流域；土壤；分离；培养；DNA提取

中图分类号S154.38+3；Q939.5文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0004-03

Isolation， Culture and DNA Extraction of Actinomycetes from Soil in Maotai Section of Chishui River Basin

LI Xiaoxia1， 2， GUI Xiaowei1，XIAO Zhongjiu1， 2

（1.College of Biology，Agricultural Science and Technology，Zunyi Normal College，Zunyi， Guizhou 563006；2.Key Laboratory of Regional Characteristic for Conservation and Utilization of Plant Resource in Chishui River Basin， Zunyi， Guizhou 563006）

Abstract[Objective] To isolate and culture actinomycetes in the soil from Maotai Section of Chishui River Basin in Guizhou to make DNA extraction.[Method] Soil samples were collected from Chishui River Basin to isolate and culture actinomycetes by using dilution method and scraping line method.And their morphological characteristics were observed.The genomic DNA was extracted from actinomycetes by using CTAB method.[Result] 6 strains of actinomycetes were isolated.The suitable concentration of soil suspension for the isolation of actinomycetes was 0.001 g/mL.The extracted DNA from actinomycetes had complete bands with the size of about 23.13 kb.[Conclusion] The research results can provide test materials and theoretical basis for further exploitation and utilization of actinomycetes.

Key wordsActinomycete；Chishui River Basin；Soil；Isolation；Culture；DNA extraction

基金項目国家自然科学基金项目（31600030）；贵州省科技厅自然科学基金项目（黔科合J字LKZS〔2012〕18号）；贵州省科技创新人才团队建设项目（黔科合人才团队〔2012〕4004号）。

放线菌是属于一类具有分支状菌丝体、以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌，细胞DNA的GC含量较高[1]。土壤是人类赖以生存的物质基础，也是放线菌生活的最主要场所。放线菌是一类重要的可再生资源，因为能产生许多种抗生素而受到重视，是一种重要的资源微生物。目前临床上使用的抗生素，有60%以上是由放线菌发酵生产的[2]。放线菌还能产生酶抑制剂、免疫抑制剂及其他生理活性物质，如他汀类药物（Statins）已经成功应用于临床上高脂血症和糖尿病的治疗，此外，产生的酶（如纤维素酶）早已在工业上应用。放线菌在生产微生物农药、农用抗生素、植物生长调节剂以及石油脱蜡、污水净化等方面也有广泛应用。

赤水河是我国长江上游支流，全长523 km，流域面积2.04 万km2，于仁怀市南部龙井乡进入贵州省，该段流域属于暖温带高原气候，是我国茅台酒以及董酒、习酒、郎酒等数十种闻名中外美酒的发源地，因其独特的地理环境，蕴藏着丰富的微生物资源[3]。笔者对赤水河流域土壤放线菌进行了分离、培养与DNA提取，旨在为放线菌的进一步开发与利用提供试验材料和理论依据。

1材料与方法

1.1供试土样及其预处理

供试土样采自贵州省赤水河流域茅台段。土样参照郭斌等[4]的方法进行预处理：选取肥沃的土壤，去除表面落叶及碎石等，取5～10 cm深的土壤，将采集的土样置于无菌纸袋中备用，或置于-20 ℃冰箱中保存，注意切勿使土壤变潮生霉[4]，土样自然风干5～30 d；取用时用研钵尽量将土样研碎，置于120 ℃烘箱中烘烤60 min，以减少细菌和真菌的出菌率，增加产孢放线菌的数量。

1.2培养基

高氏1号合成琼脂培养基：KNO3 1.0 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、可溶性淀粉20.0 g、琼脂15.0～25.0 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃下灭菌20 min。

1.3主要仪器

电热恒温培养箱；AR-224CN电子分析天平；Legond 台式微量离心机；WD-9405脱色摇床；DYCZ-20A DNA序列分析电泳槽；SW-CJ-1FD超净工作台；WD-9413A凝胶成像分析仪；GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱等。

1.4主要试剂琼脂糖、CTAB溶液、氯仿、异丙醇、乙醇等。

1.5试验方法

1.5.1放线菌的分离。采用土壤稀释分离法分离土壤中的放线菌。①称取已研细的土壤样品1.0 g置于含99 mL无菌水的三角瓶中，振荡5～10 min，使土样充分打散，即制成0.01 g/mL浓度的土壤悬液。

②用无菌移液管吸取0.01 g/mL的土壤悬液0.5 mL，吹入4.5 mL无菌水中，即为0.001 g/mL土壤悬液，如此重复，可依次制成0.001、0.000 1、0.000 01 g/mL的土壤悬液。取制成的4种不同浓度的土壤悬液，在每管中加入10%酚液5～6滴[5]，摇匀，静置片刻，然后各取0.1 mL上述土壤悬液加至高氏1号琼脂合成培养基上，用无菌涂布器平放于平板表面，轻轻地来回推动，使之涂布均匀。每个浓度做4个平板；然后，将接种好的平板倒置，置于30 ℃恒温培养箱中培养5～7 d，观察生长的菌落，用于进一步纯化分离。

1.5.2菌株纯化。待菌种生长好后，用接种针从待纯化的放线菌菌种挑取少量菌样，在高氏1号合成琼脂培养基上划线分离，采用的划线方法是分区划线。待长出单菌落后，再挑出划线，依此方法，直至得到无杂菌污染的菌落[6]。

1.5.3菌株保存。将分离、纯化得到的放线菌单菌落转接在高氏1号合成琼脂培养基上斜面培养，待其生长好后，置于4 ℃冰箱中保存，每株菌保存2管。

1.5.4放线菌总 DNA 的提取与检测。采用CTAB法提取放线菌总DNA：①将2%CTAB 提取液65 ℃下预热10 min；②用无菌刀片刮取微生物菌落于研钵中，加入1 mL CTAB提取液、72 μL溶菌酶（终浓度20 mg/mL）和适量石英砂进行研磨，将其转至灭菌的 2 mL 离心管，加入600 mL氯仿 （三氯甲烷），混合均勻后4 ℃下12 000 r/min离心10 min；

③将上清液转入另一离心管中，再次加入600 mL氯仿 （三氯甲烷），混合均匀后4 ℃下12 000 r/min离心10 min；④将上层水相转入新的2 mL离心管中，加入700 μL异丙醇（预冷），混匀，置于-10 ℃冰箱中10 min；4 ℃下12 000 r/min离心10 min；⑤弃上清液，用 75%乙醇洗涤，7 500 r/min离心 5 min，重复2次，倒扣于滤纸上晾干；⑥加入 25 μL 无菌水溶解DNA，4 ℃下保存过夜；⑦取提取的基因组 DNA 5 μL，进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳（电压 80～100 V， 40～50 min），使用全自动凝胶成像分析仪观察并照相。

2结果与分析

2.1放线菌分离0.1 mL土壤稀释液在高氏1号合成琼脂培养基中培养放线菌，大多数放线菌生长较缓慢，30 ℃下培养5～7 d后，产生可深入培养基内的营养菌丝和生长于表面的气生菌丝，并形成无性孢子。放线菌的菌落形态多干燥致密，不透明，呈粉末状，由于孢子、气生菌丝和营养菌丝颜色不同，常使菌落正反面呈不同颜色，有橙黄色、灰色、白色、浅棕色、黑色等，有些表面覆盖1层粉沫状的孢子（图1 Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ），有些菌落可以产生水溶性色素（图1 Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ）。

2.2形态特征

采用插片法对培养的放线菌进行形态观察。先将融化冷却至60 ℃的高氏1号合成琼脂培养基倒在平板上，每皿倒入约20 mL，凝固后将已灭菌的盖玻片用镊子倾斜插入平板上（深度约占盖玻片长度的1/2），插时用力要适度，以免将平板底部戳穿；然后，用无菌接种环挑取少量的已纯化菌种接种到盖玻片一侧的基部，且仅接种到其中央位置约占盖玻片宽度的一半，以免菌丝蔓延到盖玻片的另一侧。每皿插4片，将平板倒置，30 ℃下培养5～7 d； 取出插片擦去背面附着物，放在载玻片上，分别用低倍光学显微镜、高倍光学显微镜观察基内菌丝、气生菌丝的粗细以及孢子丝排列方式等。从图2可以看出，基内菌丝无分隔，长度不定。气生菌丝发达，直生或分支丝状，成熟后生成孢子丝，孢子丝排列方式随菌种而不同，有的呈螺旋状，有的呈波浪弯曲形。由此可见，纯化的菌株为放线菌，不是霉菌等非目的菌株。

2.3放线菌的基因组 DNA 提取

可以看出，6号放线菌总DNA约为23.13 kb，DNA条带清晰明亮，得率较高，说明DNA提取效果较好，因此提取DNA可作为后续PCR扩增的材料。3结论

（1）用0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 g/mL的土壤悬液进行放线菌分离，其中0.01 g/mL土壤悬液长出的菌落最多，但杂菌也较多，特别是细菌最多；0.001 g/mL土壤悬液长出的菌落次之，杂菌较少；0.000 1 g/mL土壤悬液长出的菌落很少，0.000 01 g/mL土壤悬液几乎不长或只长1～2个菌落。因此，0.001 g/mL土壤悬液最适宜分离放线菌。

（2）放线菌为革兰氏阳性菌，肽聚糖含量多，且交联程度高，因此其细胞壁不易破裂。破裂细胞壁有多种方法，包括

液氮研磨法、酶解法、研钵研磨法等。该研究中采用液氮快速研磨法，并且在提取的过程中加入溶菌酶，加速了放线菌细胞壁的破碎，DNA释放完全，提取效果非常好。此外，在试

验中研磨时间不易掌握，若研磨时间过短会使细胞内的DNA不能充分释放，获得的DNA量变少，影响试验结果；若研磨时间过长，容易导致DNA片段破裂与降解等。因此，研钵要预冷，研磨时间最好控制在2 min以内。

参考文献

[1]

蒋云霞，郑天凌，田蕴.红树林土壤微生物的研究：过去、现在、未来[J].微生物学报， 2006，46（5）：848-851.

[2] 张永光，李文均，张忠泽，等.碱性环境中的放线菌的生物学研究[J].微生物学通报， 2003，30（1）：73-76.

[3] 黄亦君.发生学视野下的贵州红色文化[J].理论与当代，2012，24（5）：21-25.

[4] 郭斌，吴晓磊，钱易.提高微生物可培养性的方法和措施[J].微生物学报，2006，46（3）：504-507.

[5] 安德荣，慕小倩，刘翠娟，等.土壤拮抗放线菌的分离和筛选[J].微生物学杂志，2002，22（5）：1-3.

[6] 安德荣，慕小倩，赵文军，等.土壤放线菌分离中抑制剂的应用研究[J].西北农业学报，2002，11（1）：106-108.

安徽农业科学2017年