miR—27b在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞上皮间质转化及他莫昔芬耐药中的调控机制

李秀楠　吴玉梅　刘爱蕙

[摘要] 目的 探讨miR-27b在雌激素受体（ER）阳性的乳腺癌细胞上皮间质转化及他莫昔芬耐药中的调控机制。 方法 通过反转录实时定量PCR测定miR-27b的表达。用双荧光素酶报告和蛋白质印迹实验验证miR-27b对HMGB3的靶向调控作用。在他莫昔芬敏感（TamS）或耐药（TamR）的MCF-7细胞中过表达miR-27b或敲减HMGB3后测定细胞活力，分析上皮和间质标志物的表达，检测细胞侵袭力。 结果 TamR MCF-7细胞中miR-27b的水平约为TamS MCF-7细胞的20%。过表达miR-27b增加了4-羟基他莫昔芬（4-OHT）对TamR MCF-7细胞的活力抑制。TamS与TamR细胞在miR-27b过表达后，穿膜细胞数目均明显减少。在TamR MCF-7细胞中，转染miR-27b mimics增加了约3倍的E-cadherin表达，同时也降低了约70%的N-cadherin表达。miR-27b可以结合预测的HMGB3 3′非翻译区（UTR）结合位点并降低HMGB3在蛋白水平的表达。HMGB3敲减和miR-27b过表达具有类似的生物学功能。 结论 miR-27b可以通过抑制HMGB3的表达抑制乳腺癌细胞上皮间质转化并增强乳腺癌细胞他莫昔芬敏感性。

[关鍵词] 雌激素受体；乳腺癌；miR-27b；他莫昔芬；HMGB3

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0058-05

[Abstract] Objective To investigate regulation mechanism of miR-27b in epithelial-to-mesenchymal transition and Tamoxifen sensitivity of ER positive breast cancer cells. Methods qRT-PCR was performed to detect miR-27b expression. Dual luciferase assay and Western blot assay were performed to detect the regulative effect of miR-27b on HMGB3 expression. Tamoxifen sensitive （TamS） and tamoxifen resistant （TamR） MCF-7 cells were transfected with miR-27b mimics or HMGB3 siRNA. Then cell viability， the expression of epithelial and mesenchymal markers and cell invasion were measured. Results TamR MCF-7 had approximately 20% of miR-27b expression compared to TamS MCF-7 cells. miR-27b overexpression significantly enhanced the suppressive effect of 4-hydroxytamoxifen on cell viability in TamR MCF-7 cells. miR-27b overexpression significantly inhibited cell invasion in both TamS and TamR cells. In TamR MCF-7 cells， transfection of miR-27b mimics resulted in approximately 3 folds increase of E-cadherin and 70% decrease of N-cadherin. miR-27b could bind to the predicted binding site in the 3′UTR of HMGB3 and decrease HMGB3 expression at protein level. Knockdown of HMGB3 phenocopied the effects of miR-27b. Conclusion miR-27b can inhibit epithelial-to-mesenchymal transition and sensitize ER positive breast cancer cells to tamoxifen via targeting HMGB3.

[Key words] ER； Breast cancer； miR-27b； Tamoxifen； HMGB3

他莫昔芬与雌二醇竞争结合雌激素受体（ER），广泛应用于ER阳性乳腺癌术后的辅助治疗[1-2]。虽然他莫昔芬的临床运用显著提高了患者的生存期，但乳腺癌细胞通常会在一段时间治疗后出现他莫昔芬耐药，导致肿瘤复发和治疗失败[1，3]。

研究发现，乳腺癌细胞获得性他莫昔芬耐药通常伴随多种miRNA的异常表达[4-6]。如4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理后，ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞中miR-574-3p表达降低，导致了网格蛋白重链异常升高，从而参与了他莫昔芬耐药[7]。乳腺癌细胞中miR-320的降低可以通过增加cAMP调控的磷酸蛋白（ARPP-19），雌激素相关受体γ及其下游效应分子的表达，包括c-Myc和细胞周期蛋白D1，导致获得性他莫昔芬耐药[8]。有研究指出，miR-27b低表达也与乳腺癌细胞获得性他莫昔芬耐药密切相关[9]。但miR-27b在乳腺癌细胞中的下游调控机制还不是很清楚。本研究拟探讨miR-27b/HMGB3调控轴对ER阳性乳腺癌细胞上皮间质转化和他莫昔芬敏感性的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

ER阳性且他莫昔芬敏感（TamS）的乳腺癌细胞MCF-7购自美国ATCC细胞库。采用低剂量逐步加量法诱导他莫昔芬耐药的（TamR）MCF-7细胞。肿瘤细胞用RMPI-1640培养基培养，添加10% FBS，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U青霉素/mL和100 μg链霉素/mL。

1.2 细胞转染

miR-27b模拟物（mimics），HMGB3si-RNA（si-HMGB3）和对应的阴性对照购自锐博生物。参考转染试剂Lipofectamie 2000（Invitrogen）说明书进行转染。

1.3 生物信息学预测

使用Target Scan 7.1预测miR-27b和HMGB3的结合位点。

1.4 RNA提取及实时荧光定量

按照TRIzol RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。应用TaqMan miRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）将RNA逆转录为cDNA。用TaqMan miRNA分析试剂盒检测miR-27b的表达。所有qRT-PCR实验均使用Applied Biosystems 7500实时定量PCR仪进行。RNA的相對表达量使用2-ΔΔCT法计算。

1.5 细胞活力检测

取转染miR-27b mimics或HMGB3 siRNA后24 h的TamS或TamR MCF-7细胞，接种于96孔板（3×103个细胞/孔），继续培养24 h。之后，将培养基换为5 μmol/L的4-OHT培养基。细胞继续培养72 h后进行CCK-8检测细胞活力。

1.6 Transwell侵袭实验

将基质胶铺于小室底部，小室下层加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液500 μL，上层加入无血清的RPMI 1640培养液100 μL。转染48 h后，制备细胞悬液，小室上层铺500 μL的细胞悬液（含1×105个细胞），继续培养24 h后，4%甲醛固定、0.1%结晶紫染色后在显微镜下（100×）随机挑取10个视野计数穿膜的细胞计算其均数和标准差。

1.7 蛋白质印迹分析

细胞样品应用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。蛋白样品按30 μg/孔在10% SDS-PAGE进行电泳分离，转膜，封闭。后用相应一抗于4℃孵育过夜，洗涤。加二抗孵育，洗涤。加入增强型化学发光试剂，X线曝光、显影和定影。以目的蛋白质条带的灰度值与内参β-actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.8 双荧光素酶报告实验

将含预测的野生型miR-27b结合位点的HMGB3 3′UTR序列片段和含突变型miR-27b结合位点的HMGB3 3′UTR序列片段分别插入荧光素酶报告质粒pmirGLO（Promega）的Xhol和Xbal位点之间。重组质粒分别命名为pGLO-HMGB3-WT和pGLO-HMGB3-MT。将miR-27b mimics、mimics对照分别与内参对照和荧光素酶报告载体共转染入MCF-7细胞中。转染24 h后，采用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System进行样品Luciferase活性检测。

1.9 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-27b对ER阳性乳腺癌他莫昔芬敏感性和侵袭力的调控

TamR MCF-7细胞中miR-27b的水平约为TamS MCF-7细胞的20%（图1A）。5 μmol/L的4-OHT处理并不能抑制TamR MCF-7细胞的活力；但在TamR MCF-7细胞中过表达miR-27b后，5 μmol/L的4-OHT处理则导致约15%的细胞活力抑制（图1B）。TamS MCF-7与TamR MCF-7细胞在miR-27b过表达后，穿膜细胞数目均明显减少，差异有统计学意义（P = 0.028、0.006）（图1C、图1D）。

2.2 miR-27过表达对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响

蛋白质印迹分析结果证明，TamR MCF-7细胞中，miR-27b过表达增加了约3倍的E-cadherin表达，降低了约70%的N-cadherin表达（图2）。

2.3 miR-27b对HMGB3在乳腺癌细胞中表达的影响

生物信息学结果显示，在HMGB3 3′非翻译区有一个可能的miR-27b结合位点（图3A）。在TamS和TamR MCF-7细胞中，过表达miR-27b可以降低HMGB3蛋白表达（图3B）。为了进一步验证miR-27b是否与预测的HMGB3 3′UTR结合位点有直接结合作用，将野生型和突变型的HMGB3 3′UTR片段插入pmirGLO荧光素酶表达载体后进行miR-27b结合实验。结果显示，miR-27b可以显著抑制pGLO-HMGB3-WT的荧光素酶在TamS和TamR MCF-7细胞中的表达，但是并不能抑制pGLO-HMGB3-MT的荧光素酶表达（图3C、图3D），说明miR-27b可以结合预测HMGB3 3′UTR结合位点。

2.4 HMGB3敲减对乳腺癌细胞的影响

HMGB3 siRNA显著抑制了HMGB3的表达（图4A）。TamR MCF-7细胞在抑制HMGB3后，5 μmol/L的4-OHT处理导致了约20%的细胞活力抑制（图4B）。抑制HMGB3也显著减少了TamS和TamR MCF-7细胞穿膜细胞数目（P = 0.009、0.004）（图4D）。HMGB3 siRNA显著增加了E-cadherin表达，同时也明显降低了N-cadherin表达（图4C）。

3 討论

研究发现，多个miRNA在TamR乳腺癌细胞中表达显著下降，包括miR-497，miR-221/222，miR-195和miR-27b[10]。miR-27b可以参与多项乳腺癌病理发展过程。如miR-27b表达下降与ErbB2依赖的乳腺上皮细胞癌变和侵袭力增强密切相关[11]。miR-27b表达降低也导致了ENPP1激活，从而参与了乳腺癌肿瘤干细胞的发生[9]。在多种肿瘤细胞中，miR-27b低表达也与癌细胞的化疗敏感性相关。如miR-27b过表达可以在胃癌细胞中激活p53依赖的细胞程序性死亡，减少CYP1B1调控的药物减毒作用，从而增加肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感性[12]。在乳腺癌细胞中，miR-27b过表达可以通过减少侧群细胞的形成，从而降低获得性的药物耐药[9]。

上皮间质转化不仅是肿瘤细胞获得更强侵袭力的重要机制之一[13]，也是获得性他莫昔芬耐药的重要机制之一[14-15]。如果在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞中恢复一些下调的miRNA的表达，如miR-375和miR-200，可以部分逆转乳腺癌细胞的上皮间质转化，并增加他莫昔芬的敏感性[14-16]。本研究发现，在他莫昔芬耐药的MCF-7细胞中恢复miR-27b的表达，可以显著增加他莫昔芬对细胞活力的抑制，减弱肿瘤细胞的侵袭力，同时也部分逆转了肿瘤细胞的上皮间质转化。

人高迁移率族蛋白（HMG-box）在肿瘤细胞的DNA复制、转录、重组和修复中有重要的生理功能[17-18]。在乳腺癌中，HMGB3是一个原癌基因，并且可以调控肿瘤细胞的增殖、转移和耐药性[19-20]。本研究证实，miR-27b可以结合预测HMGB3的3′UTR结合位点，降低HMGB3的表达。HMGB3敲减具有类似miR-27b过表达的生物学功能，可以减弱乳腺癌细胞的他莫昔芬耐药性，减弱细胞侵袭力，也部分逆转了癌细胞的上皮间质转化。因此，HMGB3很有可能是miR-27b在乳腺癌细胞中的重要下游靶点。

本研究只用了一种他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞，这是本研究的局限性。后续研究拟用多种乳腺癌肿瘤细胞系和基于裸鼠的体外肿瘤模型对miR-27b和HMGB3的作用机制及参与的信号调控网络进行深入研究。

[参考文献]

[1] Early Breast Cancer Trialists' Collaborative G. Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival：an overview of the randomised trials [J]. Lancet，2005，365（9472）：1687-1717.

[2] Peifer C，Alessi DR. New anti-cancer role for PDK1 inhibitors：preventing resistance to tamoxifen [J]. Biochem J，2009，417（1）：e5-e7.

[3] Luqmani YA，Alam-Eldin N. Overcoming resistance to endocrine therapy in breast cancer：new approaches to a nagging problem [J]. Med Princ Pract，2016，25 Suppl 2：28-40.

[4] Nagini S. Breast Cancer：current molecular therapeutic targets and new players [J]. Anticancer Agents Med Chem，2016.[Epub ahead of print]

[5] Miller TE，Ghoshal K，Ramaswamy B，et al. MicroRNA-221/222 confers tamoxifen resistance in breast cancer by targeting p27Kip1 [J]. J Biol Chem，2008，283（44）：29897-29903.

[6] Egeland NG，Lunde S，Jonsdottir K，et al. The Role of MicroRNAs as predictors of response to tamoxifen treatment in breast cancer patients [J]. Int J Mol Sci，2015，16（10）：24243-24275.

[7] Ujihira T，Ikeda K，Suzuki T，et al. MicroRNA-574-3p，identified by microRNA library-based functional screening，modulates tamoxifen response in breast cancer [J]. Sci Rep，2015，5：7641.

[8] Lu M，Ding K，Zhang G，et al. MicroRNA-320a sensitizes tamoxifen-resistant breast cancer cells to tamoxifen by targeting ARPP-19 and ERRgamma [J]. Sci Rep，2015，5：8735.

[9] Takahashi RU，Miyazaki H，Takeshita F，et al. Loss of microRNA-27b contributes to breast cancer stem cell generation by activating ENPP1 [J]. Nat Commun，2015，6：7318.

[10] Chu J，Zhu Y，Liu Y，et al. E2F7 overexpression leads to tamoxifen resistance in breast cancer cells by competing with E2F1 at miR-15a/16 promoter [J]. Oncotarget，2015， 6（31）：31944-31957.

[11] Pincini A，Tornillo G，Orso F，et al. Identification of p130Cas/ErbB2-dependent invasive signatures in transformed mammary epithelial cells [J]. Cell Cycle，2013，12（15）：2409-2422.

[12] Shang Y，Feng B，Zhou L，et al. The miR27b-CCNG1-P53-miR-508-5p axis regulates multidrug resistance of gastric cancer [J]. Oncotarget，2016，7（1）：538-549.

[13] Hiscox S，Jiang WG，Obermeier K，et al. Tamoxifen resistance in MCF7 cells promotes EMT-like behaviour and involves modulation of beta-catenin phosphorylation [J]. Int J Cancer，2006，118（2）：290-301.

[14] Ward A，Balwierz A，Zhang JD，et al. Re-expression of microRNA-375 reverses both tamoxifen resistance and accompanying EMT-like properties in breast cancer [J]. Oncogene，2013，32（9）：1173-1182.

[15] Manavalan TT，Teng Y，Litchfield LM，et al. Reduced expression of miR-200 family members contributes to antiestrogen resistance in LY2 human breast cancer cells [J]. PLoS One，2013，8（4）：e62334.

[16] Bai JX，Yan B，Zhao ZN，et al. Tamoxifen represses miR-200 microRNAs and promotes epithelial-to-mesenchymal transition by up-regulating c-Myc in endometrial carcinoma cell lines [J]. Endocrinology，2013，154（2）：635-645.

[17] Stros M. HMGB proteins：interactions with DNA and chromatin [J]. Biochim Biophys Acta，2010，1799（1-2）：101-113.

[18] Agresti A，Bianchi ME. HMGB proteins and gene expression [J]. Curr Opin Genet Dev，2003，13（2）：170-178.

[19] Elgamal OA，Park JK，Gusev Y，et al. Tumor suppressive function of mir-205 in breast cancer is linked to HMGB3 regulation [J]. PLoS One，2013，8（10）：e76402.

[20] Chen X，Zhao G，Wang F，et al. Upregulation of miR-513b inhibits cell proliferation，migration，and promotes apoptosis by targeting high mobility group-box 3 protein in gastric cancer [J]. Tumour Biol，2014，35（11）：11081-11089.

（收稿日期：2016-09-18 本文編辑：李亚聪）