乙氧氟草醚对泥鳅的毒性研究

夏晓华++霍蔚然++李墨溢++董慧++夏晓培++杜启艳++常重杰

摘要：为了检测除草剂乙氧氟草醚对水生生物的毒性，以泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）为试验对象，通过急性毒性试验、微核试验、单细胞凝胶电泳试验，来检测其对泥鳅的毒性效应。结果表明，乙氧氟草醚对泥鳅在24、48、72、96 h的半数致死浓度（LC50）分别为36.66、32.86、28.92、27.39 mg/L，安全浓度（SC）为7.92 mg/L。微核率和核异常率均随着染毒浓度的增加和时间的延长不断升高，呈现明显的时间剂量效应关系。在处理6 d的最高浓度，微核率和核异常率达到最大，分别为6.417‰±0.631‰和65.417‰±5.080‰。单细胞凝胶电泳试验中，选取彗尾DNA含量、尾长、尾矩3个指标作为检测DNA受到损伤的认定标准，结果处理6 d的16.00 mg/L浓度达到峰值，单细胞彗尾DNA含量为43.06%±2.54%，尾长为268.00 pix±8.49 pix，尾矩为89.31±1.82。试验结果为乙氧氟草醚的合理使用以及环境污染监测提供了科学依据。

关键词：泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）；乙氧氟草醚；半数致死浓度；微核；单细胞凝胶电泳技术

中图分类号：S966.4+91 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1522-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.029

Study on the Toxicity of Oxyfluorfen to Misgurnus anguillicaudatus

XIA Xiao-hua1， HUO Wei-ran1， LI Mo-yi2， DONG Hui1， XIA Xiao-pei1， DU Qi-yan1， CHANG Zhong-jie1

（1.College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China；

2.The Affiliated High School of Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： In order to estimate the herbicide toxicity of oxyfluorfen to aquatic organisms， regarding the Misgurnus anguillicaudatus Cantor as the experimental object， we adapted the acute test， micronucleus test， single cell gelelectrophoresis to test its toxicity on M. anguillicaudatus. The results showed that， the half lethal concentration（LC50） of oxyfluorfen on the 24， 48， 72， 96 h were 36.66， 32.86， 28.92， 27.39 mg/L； respectively； the safe concentration（SC） was 7.92 mg/L. The micronucleus rate and nuclear anomalies in each experiment were increased with exposure time and concentration， which presents obvious time dose effect. The highest micronuclei and nuclear anomalies' rate reached the maximum which appeared in the highest concentration on 6 d. The results were permill 6.417‰±0.631‰， 65.417‰±5.080‰， respectively. In the comet assay， we chose the content of comet tail DNA， tail length and the olive tail moment（these three standards） to check the injure degree of DNA. The results showed that they reached to the peak value on 6 d and 16.00 mg/L. The peak value was 43.06%±2.54%， 268.00 pix±8.49 pix， 89.31±1.82， respectively. The studies showed scientific references for effective use of oxyfluorfen and environmental pollution monitoring.

Key words： Misgurnus anguillicaudatus Cantor； oxyfluorfen； LC50； micronucleus； single cell gel electrophoresis

现代生态农业养殖模式——嵌套养殖已经被越来越多的养殖户青睐，而市面上常见的嵌套养殖模式当属泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）-水稻模式。为了有效防治稻田病虫害、杂草，提高水稻产量，施用农药是重要的农艺措施之一，乙氧氟草醚便是常用的稻田除草劑。稻田中使用除草剂去除杂草的同时，大量散失的农药也将流入到稻田水体中，这会给水体里的生物特别是稻田里面嵌套养殖的泥鳅带来很大毒害，不仅给农户造成经济损失，而且这些有毒物质会通过食物链的富集、传导作用转移到人体内，从而引起人和动物的积累性中毒，对人类的健康构成了潜在的威胁[1]。因此应合理使用农药，在有效防治病虫草害的同时，降低农药对农产品和环境的污染，达到可持续发展的目的。试验以泥鳅为受试对象，通过急性毒性试验、微核试验、单细胞凝胶电泳技术检测乙氧氟草醚对泥鳅遗传物质DNA的损伤程度，评估了乙氧氟草醚对稻田中嵌套养殖泥鳅的遗传毒性水平，以期为合理使用除草剂、高效养殖泥鳅、推广现代生态农业养殖模式嵌套养殖及环境污染监测提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

参试泥鳅购自新乡市海鸿农贸市场，选择发育状况良好、体重13～16 g、平均体长9～12 cm的健壮泥鳅350尾，试验前用曝气3 d的自来水驯养一周，驯养期间死亡率小于2%，挑选健康、体表无损的个体作为试验材料。试验前1 d停止喂食，进行饥饿处理，试验期间不投喂。乙氧氟草醚除草剂购自新乡市东海农资市场，上海惠光化学有限公司出品，有效成分含量23.5%。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验 在前期预备试验的基础上，确定最大零致死浓度为乙氧氟草醚稀释液20.00 mg/L、最小全致死浓度为45.00 mg/L。正式试验在这2个浓度之间设置20.83、25.00、30.00、36.00、43.20 mg/L 5个乙氧氟草醚稀释液浓度梯度处理和1个空白对照处理，每处理投放10尾健康泥鳅，每24 h更换一次等体积等浓度的乙氧氟草醚稀释液。试验开始后12 h连续观察，并记录其中毒症状；及时清理死亡个体，记录泥鳅在24、48、72、96 h的死亡数量。采用改进寇氏法（Karber）[2，3]计算乙氧氟草醚对泥鳅的半数致死浓度（LC50），LC50的计算公式为：

LgLC50=Xm-i（∑p-0.5），

式中，Xm为死亡处理最大剂量的对数，i为相邻处理浓度的对数之差，∑p为各处理死亡率之和。安全浓度SC的计算公式为：

SC=LC50（24 h）×0.3/[（LC50（24 h）/LC50（48 h）]3。

1.2.2 微核试验 在急性试验毒性的基础上，于安全浓度和最大零致死浓度之间，设置5个乙氧氟草醚浓度处理，分别是0.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/L，每处理均随机投放20尾健康泥鳅，每24 h更换一次等体积等浓度的乙氧氟草醚稀释液。分别设置2、4、6 d 3个时间段，试验步骤参照文献[4]的方法完成。微核试验处理的数据有：

核异常率=（异常核的细胞数/总细胞数）× 1 000‰，

微核率=（双核的细胞数/总细胞数）×1 000‰。

1.2.3 单细胞凝胶电泳试验 单细胞（血细胞）悬浮液的制备步骤参照文献[5]的方法。泥鳅的单细胞凝胶电泳试验分别设置2、4、6 d 3个时间段处理，以试验开始时间0为对照，各个时间段处理都设置4个乙氧氟草醚浓度，分别是8.00、12.00、16.00、20.00 mg/L；运用CASP彗星图像分析软件及统计软件SPSS 11.0对各处理的彗尾DNA所占含量（Tail DNA，%）、尾长（TL，pix）和Olive尾距（OTM）进行分析。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

试验观察发现，不同浓度的乙氧氟草醚稀释液对泥鳅活动有相对明显的影响。低剂量处理中，泥鳅基本上没出现明显的生理反应；但在高剂量处理中，泥鳅不断地快速游动，有狂游跃出水面的现象，最终逐渐失去游动能力、翻白肚直至死亡；不同浓度的乙氧氟草醚稀释液对泥鳅的急性毒性试验结果见表1。由表1可知，乙氧氟草醚稀释液对泥鳅的24、48、72、96 h的 LC50分别为36.66、32.86、28.92、27.39 mg/L，SC为7.92 mg/L。

2.2 微核試验

不同浓度的乙氧氟草醚稀释液对泥鳅的微核试验结果见表2。从表2可见，对照处理的泥鳅红细胞自发微核和核异常细胞率在各处理时间上无明显个体差异；而乙氧氟草醚处理的浓度越高，在处理时间一定的条件下，泥鳅的血细胞微核率和核异常率越高，各乙氧氟草醚稀释液浓度处理都与对照之间存在极显著差异（P<0.01）；并在20.00 mg/L的浓度下达到最高，处理6 d的微核率达到6.417‰±0.631‰，核异常率达到65.417‰±5.080‰。并且处理6 d的微核率和核异常率都比处理4 d与2 d的高。

2.3 单细胞凝胶电泳试验

乙氧氟草醚稀释液处理泥鳅后单细胞（血细胞）凝胶电泳比较情况见图1。由图1可见，对照的细胞核呈圆球形，头部DNA集中；而在乙氧氟草醚稀释液各处理中，细胞核呈现彗星样，具有长度不同的慧尾，而且随着浓度的增加，彗星头部逐渐缩小，变得发散。利用彗星图像分析软件CASP及统计软件SPSS 11.0测量与统计分析单细胞凝胶电泳情况，结果见表3。从表3可见，在处理2 d的单细胞中，泥鳅的彗尾DNA含量、尾矩、尾长随着乙氧氟草醚浓度的增加，各数值都明显增大，与对照都存在极显著差异（P<0.01）或显著差异（P<0.05），并在20.00 mg/L时达到峰值，此时单细胞彗尾DNA含量为28.17%±1.32%，尾长为165.00 pix±4.24 pix，尾矩为31.34±5.25，说明在处理时间为2 d的情况下，乙氧氟草醚稀释液随着浓度的增加，对泥鳅细胞的DNA损伤也越严重。在处理4 d的单细胞中，试验结果所呈现的趋势大致与处理2 d相同，且3项数值在20.00 mg/L中同样也达到峰值，单细胞彗尾DNA含量为29.99%±4.06%，尾长为219.00 pix±25.46 pix，尾矩为51.34±8.26，与对照相比都存在极显著差异（P<0.01），并且较处理2 d而言，3项数值都有了大幅度提升，说明乙氧氟草醚稀释液对泥鳅细胞DNA的损伤有时间剂量效应。而在6 d的各处理中，3项数值在16.00 mg/L浓度中达到峰值，彗尾DNA含量为43.06%±2.54%，尾长为268.00 pix±8.49 pix，尾矩为89.31±1.82。

3 讨论

3.1 乙氧氟草醚的毒性分类

急性毒性试验结果显示，低浓度处理24 h和48 h的泥鳅死亡率并没有明显的变化；高浓度处理中随着乙氧氟草醚浓度的不断升高，泥鳅的死亡率明显上升，且随着染毒时间的增加，泥鳅的死亡率均呈上升态势，说明乙氧氟草醚对泥鳅毒性存在时间-剂量效应。2009年新版的《国际海运危险货物规则》中将化学物质对鱼类的毒性分为3个等级[6]，其中96 h的LC50大于10.00 mg/L时属于低毒。本试验中乙氧氟草醚对泥鳅的96 h的LC50为27.37 mg/L，大于10.00 mg/L，由此说明除草剂乙氧氟草醚对泥鳅属于低毒。

3.2 乙氧氟草醚对泥鳅单细胞DNA的损伤程度

除草剂中的致变物质能使泥鳅部分单细胞（血细胞）染色体发生断裂或破坏其纺锤体，使之在有丝分裂过程中染色体断片残留于间期胞浆中形成微核；微核细胞率的高低可反映细胞染色体受损伤的程度[7]。试验中，泥鳅单细胞的微核率和核异常率均随着乙氧氟草醚浓度的升高和时间的延长而增加。高浓度处理的泥鳅单细胞微核率和核异常率明显要比低浓度处理的高。这可能是由于处理浓度过高后，使泥鳅单细胞自身修复机制失效，不能够进行有效的自我修复，导致单细胞的核异常率和微核率提高造成的。

单细胞凝胶电泳试验与经典的染色体畸变、微核相比，不仅可以研究低剂量下的生物效应，也可用于研究高剂量下的生物效应；既可以用于活细胞DNA的检测，也能用于死亡细胞DNA的分析。因此单细胞凝胶电泳试验非常适用于评价受试对象的遗传毒性。试验中，处理与对照相比，彗尾DNA含量、尾长、尾矩3个指标都随着乙氧氟草醚浓度的升高以及处理时间的延长而有明显的上升。当处理时间为6 d、乙氧氟草醚处理浓度为16.00 mg/L时，彗尾DNA含量为43.06%±2.54%，尾长为268.00 pix±8.49 pix，尾矩为89.31±1.82，这3项数值均达到最大；而在之后的处理（6 d、20.00 mg/L）中3项数值都有明显的下降，可能的原因是与DNA自身的修复机制有关，DNA在受到严重损伤时，会启动SOS修复机制，使DNA的损伤程度减弱，导致拖尾出现不明显现象。单细胞凝胶电泳试验表明，乙氧氟草醚浓度越大，处理时间越长，对泥鳅DNA的损伤就越严重。

綜上所述，试验证实了乙氧氟草醚对泥鳅单细胞的遗传物质具有一定的毒性效应，为人们更好、更安全地使用此类除草剂提供了依据，值得养殖户借鉴。并且合理使用农药是嵌套养殖技术发展的关键，这对于农业生产安全和环境保护及其他相关领域都具有重要意义。

参考文献：

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[3] 惠秀娟.环境毒理学[M].北京：北京化工大学出版社，2003.270-271.

[4] 陈细香，卢昌义，黄荣昌.5种洗发剂对泥鳅红细胞微核的影响[J].淡水渔业，2007，37（5）：19-22.

[5] 陈 忻，西田浩志，小西徹也.单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化损伤及修复[J].西安交通大学学报，2007， 28（1）：25-26.

[6] 林 燕.环境有害物质分类标准的变更及监管建议探讨[A].中国航海学会中国航海学会危险货物运输专业委员会论文集[C].北京：中国航海学会，2009.72-76.

[7] 沈光平，王钦南，周祉祯.微核与染色体畸变的相关性[J].遗传，1985，7（1）：15-17.