色谱及其联用技术在硒形态分析中的应用

廖美林++马作江

摘要：硒是人体必需的微量元素，食品中的硒元素形态有多种，硒的化学形态可以影响人体补硒效果，硒形态分析研究具有重要意义。硒形态分析比传统的硒总量分析复杂很多，本研究综述了色谱及其联用技术在硒形态分析中的应用，主要包括液相色谱、气相色谱、毛细管电泳、离子色谱等光谱/质谱联用技术，以期为硒形态的分析提供理论依据。

关键词：硒；形态；色谱；联用技术

中图分类号：O657.7；O613.52 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1413-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.003

Application of Chromatography and Related Hyphenated

Techniques of Selenium Speciation Analysis

LIAO Mei-lin， MA Zuo-jiang

（National Quality Supervision and Testing Center for Selenium Rich Products/Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture Center for Food and Drug Control， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： Selenium is the essential trace elements for human body. There are many forms of selenium in food， and the effect of selenium supplement is determined by the selenium speciation， the research of speciation analysis of selenium is significance，Selenium speciation analysis is much more complex than the total content determination， the application of chromatography and related hyphenated techniques of selenium speciation analysis is reviewed， including liquid chromatography，gas chromatography，Ion Chromatography，capillary electrophoresis and related hyphenated with spectrometry/mass spectrometry. In order to provide a theoretical basis for the analysis of selenium speciation.

Key words： selenium； speciation； chromatography； hyphenated techniques

硒是人體必需的微量元素之一，硒的不同化学形态对人体的吸收、生物效应、毒性及防癌作用不同。许多日常食品中硒的可利用价值由硒的化学形态决定，硒形态主要分为无机硒和有机硒2种，无机硒的毒性大，而有机硒的毒性小。无机硒形态主要有HSe-、H2Se、金属硒化物、硒酸盐、亚硒酸盐等，有机硒的形态主要包括甲基硒、二甲基硒、二甲基二硒等硒醚，硒代氨基酸，硒蛋白，硒多糖，硒核酸等，其中硒代氨基酸和硒蛋白是生物体内最主要的有机硒存在形态。由于硒形态复杂，硒形态分析比传统的硒总量分析复杂很多。色谱分离及光谱/质谱检测技术的发展，以及各种连接技术的陆续发现，为硒的形态分析提供了技术支持。目前硒形态研究主要以硒酸盐、亚硒酸盐、硒代氨基酸等小分子硒化合物为主。分析方法主要是利用液相色谱、气相色谱、离子色谱、毛细管电泳及其联用技术实现的。根据各种含硒化合物的不同性质，采用不同的色谱及其联用技术进行分析。

1 硒形态的色谱联用检测技术

1.1 液相色谱及其联用法

液相色谱（HPLC）法是目前应用最广的色谱分离方法，与光谱或质谱技术等联用可分离无机态物质、小分子代谢物、硒代氨基酸、含硒蛋白等多种物质，是目前硒形态分析的主流方法。主要有液相色谱法（HPLC）、液相色谱与原子荧光联用法（HPLC-AFS）、液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法（HPLC-ICP-MS）、液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS）等。

1.1.1 液相色谱法 HPLC法在硒形态分析中，主要是对不同样品的预处理方法、使用的衍生试剂、流动相和色谱条件等进行研究。潘红阳等[1]优化了样品预处理方法，并建立了柱前衍生反相高效液相色谱-紫外检测富硒脱水菜心中硒代胱氨酸（SeCys）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMe-Cys）和硒代蛋氨酸（SeMet）的方法。刘建群等[2]采用柱前衍生-高效液相荧光法对硒营养强化奶粉中L-硒-甲基硒代半胱氨酸含量进行了检测。李红卫等[3]采用6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解富硒米曲霉48 h，提取样品中的有机硒，4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，再利用高效液相色谱法对其有机硒形态进行了分析。

1.1.2 液相色谱-原子荧光光谱联用法 原子荧光光谱（AFS）法在国内发展很快，是总硒含量测定的标准方法。但对于硒形态分析研究，多需要与色谱联用，现在主要是与液相色谱联用，国内已经有多款液相色谱-原子荧光光谱联用仪器（形态分析仪），是由液相色谱与氢化物原子荧光联用（HPLC-HG-AFS）的元素形态分析技术。能有效对硒、砷、汞等元素形态进行分离和检测，该技术的优势在于具备了液相分离的优点，能利用AFS的高灵敏度和元素特异性，仪器的整体价格也不高。肖志明等[4]建立了富硒酵母中Se（IV）、Se（VI）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMeCys）4种硒形态的高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱分析方法。尚德荣等[5]采用HPLC-HG-AFS法对水产品中硒的赋存形态检测进行研究。韦昌金等[6]利用离子交换液相色谱-氢化物发生双道原子荧光联用法，同时测定了富硒营养品中的4种砷形态和3种硒形态。谢小雪等[7]建立了离子交换液相色谱-原子荧光联用法同时测定水产品中硒代胱氨酸SeCys、硒代蛋氨酸SeMet和Se（VI）等3种硒形态的方法。HPLC-AFS法具有硒形态分离效果好、光谱干扰少、灵敏度高等特点，符合一般实验室的检测要求。

1.1.3 液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法

电感偶合等离子体质谱法（ICP-MS）具有较宽的动态线性范围，可以高效使待测样原子化，能同时进行几十个元素的定量测定，谱线简单，干扰相对于光谱技术要少，既可用于元素分析，还可进行同位素组成的快速测定。这些特点使得它在元素形态分析中具有重要意义，由于液相色谱的流速和ICP-MS进样速度一致，其联用接口非常简单。液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用（HPLC-ICP-MS）法是目前研究报道最多的元素形态分析方法。结合液相色谱的特点，具有进样量小、分析速度快、分离效果好、检出限低等优点。在各类食品中硒、砷、锡、汞等元素形态分析领域得到了越来越多的应用。王丙涛等[8]建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测食品中5种硒形态的方法。王欣等[9]建立了富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亚硒酸根（SeO32-）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys）、硒脲（SeUr）、硒代乙硫氨酸（SeEt）等6种硒形态的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法。Kapolna等[10]采用体积排阻色谱（SEC-HPLC）及离子对色谱（IP-RP-HPLC）与电感耦合等离子体质谱联用法对富硒韭菜的硒形态进行了研究分析。

1.1.4 液相色谱-质谱联用法 液相色谱-质谱联用法主要包括液相色谱-串联四级杆质谱法（LC-MS-MS）、液相色谱-飞行质谱联用法（LC-TOF-MS），使该法具有灵敏度高、检出限低、专一性强、分析速度快等优点，能有效排除样品中大量基质的干扰，且能分析出硒同位素丰度光谱图及其分子量信息，进行含硒化合物准确定性及定量分析。张明等[11]应用液相色谱串联质谱法（LC-MS-MS）对富硒植物中的γ-谷氨酰胺-硒甲基-硒半胱氨酸（GSeMC）、硒甲基-硒半胱氨酸（SeMC）、硒胱氨酸（SeCys）和硒蛋氨酸（SeMet）等4种有机含硒化合物进行了快速筛查分析。铁梅等[12]采用高效液相色谱-质谱联用技术对富硒大豆可溶性蛋白中的硒代蛋氨酸进行了定性定量分析。肖强等[13]采用超高压液相色谱-飞行时间质谱联用（UPLC-TOF-MS）方法同时测定了硒蛋氨酸（SeMet）和硒胱氨酸（SeCys）含量。

1.2 气相色谱及其联用法

气相色谱（GC）具有分辨率高、分析速度快、仪器设备消耗低等优点。可以直接分离检测易挥发的甲基硒、二甲基硒等硒形态化合物，而无机的硒酸盐、亚硒酸盐以及硒代氨基酸等难挥发的硒化合物，必须通过氢化物发生、酯化和氨基的酰化或烷基化等试剂反应得到沸点较低的衍生产物才能用气相色谱法实现分离检测，且衍生化步骤使分离/分析过程复杂化，增加了待测硒形态丢失的可能性。陈晓霞等[14]通过异丙醇、七氟丁酸酐等试剂将对富硒丹参中的硒蛋氨酸衍生化反应后， 采用GC法进行了分析测定。气相色谱分离多采用联用技术对硒形态进行定性定量分析。Lee等[15]分别用GC法和GC-MS法使硒代氨基酸与其他氨基酸得到有效分离，并对西兰花中的硒代氨基酸含量进行了分析。张浩等[16]采用氯甲酸乙酯衍生法，研究了硒氨基酸衍生物的一级质谱以及二级碰撞离子裂解规律，建立了硒蛋氨酸的GC-MS/MS测定方法，且对毛豆中的硒蛋氨酸含量进行了测定。段建坤[17]采用顶空吸附萃取-GC-ICP-MS法测定了洋葱的挥发性有机硒化合物。

1.3 毛细管电泳及其联用法

毛细管电泳（CE）以电渗流为驱动力、毛细管为分离通道，根据目标分子所带电荷数与分子本身大小的比值进行分离，具有高分辨率、低检测限等特点。王柏松等[18]以十二烷基三甲基溴化铵（CTAB）为电流改性剂对砷酸根和硒酸根进行了毛细管电泳分离。李平静等[19]利用动态pH界面堆积毛细管电泳法对硒代氨基酸进行了分析。冯金荣等[20]设计了一种毛细管电泳氢化物发生装置，利用该装置将（CE）分离后的2种硒形态转化為氢化物，通过CE-ICP-AES联用对其检测分析。Zhao[21]采用CE-ICP-MS联用技术，对Se（IV）、Se（VI）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys）等硒形态进行了分析检测。毛细管电泳（CE）分离效率高，操作条件温和，但是在分离过程中，样品中硒形态可能由于电解质或pH的调节而发生变化，样品的组成也是影响CE分离的一个重要因素，并且CE与ICP-MS的接口技术还不成熟。

1.4 离子色谱及其联用法

离子色谱法（IC）作为一种有效的分离和检测技术，已经在金属和非金属离子的测定中得到了较多应用，已成为解决复杂机体中超痕量硒形态分析的有效工具。秦冰等[22]采用离子色谱-积分脉冲安培检测法（HPAEC-IPAD）对茶树叶中硒代氨基酸进行定性和定量分析。林立等[23]采用离子色谱-电感耦合等离子体质谱法（IC-ICP-MS）测定了奶粉中的硒酸盐[Se（VI）]、亚硒酸盐[Se（IV）]、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代胱氨酸（SeCys）等4种硒形态。

2 硒形态的色谱联用鉴定技术

硒形态标准物质只有很少的几种，加之硒在生物体内吸收和代谢过程的复杂性和多样性，很难实现实际样品中各种含硒未知形态的分析，所以需要多种联用技术对其分子结构形态进行鉴定分析。王真真等[24]采用HPLC-MS/MS法，结合质谱数据库比对以及HPLC-ICP/MS法，对富硒玉米蛋白的酶水解物中硒肽及含硒氨基酸的结构进行鉴定。结果确定了4种含硒氨基酸及5个硒小肽。刘琼等[25]对微量含硒蛋白检测技术进展进行了综述，通过凝胶电泳与-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）检测含硒蛋白，用胰酶进行胶内酶解后，既可用毛细管高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（Cap-HPLC-ICP-MS）或纳升级高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（Nano-HPLC-ICP-MS）检测含硒多肽，也可用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行含硒蛋白的多肽质量指纹鉴定（PMF）和纳升级高效液相色谱-电喷雾串联质谱（Nano-HPLC-ESI-MS/MS）进行蛋白质识别和多肽序列测定。

3 小结

目前多种色谱联用技术是硒形态分析的主流，HPLC与ICP-MS、AFS等的联用是硒形态分析的主要方法，未知硒形态的结构鉴定中应用较多的是HPLC-MS-MS/TOF-MS等。硒形态分析难度较大，且有机硒具有多种形态，有些已经确认种类，但是也有一部分由于缺乏标准物质而无法确认，硒的形态分析方法的实用化和标准化是目前硒形态分析的瓶颈，这方面还要做大量的研究工作。

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