灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血的保护作用及机制研究

马晓静　王岚　殷小杰　王智民　刘晓谦　贡磊磊　陈两绵　梁日欣　高慧敏

[摘要] 观察灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血的保护作用，并探讨其作用机制。该实验选用SPF级雄性SD大鼠84只，隨机分为7组：假手术组、模型组、阳性药组（尼莫地平组12 mg·kg-1）、灯盏花素片组（48 mg·kg-1）、灯盏乙素乙酯高、中、低剂量组（100，50，25 mg·kg-1）。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉结扎（MCAO）模型，观察大鼠MCAO时神经功能状态，TTC染色法测脑梗死面积，半自动生化分析仪测定血清中MDA，SOD，NO的变化。分别采用200 mg·L-1OxLDL和100 μg·L-1TNFα作用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）24 h，建立OxLDL和TNFα细胞损伤模型，测定细胞上清液中MDA，SOD，NO，ET，6ketoPGF1α，TXB2，IL1，IL6，IL8，ICAM1和PECAM1水平。结果显示，灯盏乙素乙酯能有效改善MCAO大鼠神经功能，明显减小脑梗死面积。与模型组比较，血清中SOD和NO活性提高，MDA含量降低；细胞上清液中SOD，6ketoPGF1α和NO活性提高，IL1，IL6，IL8，ICAM1，PECAM1，TXB2，ET和MDA含量降低。结果表明，灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血具有一定的保护作用，其作用机制可能与抗氧化应激，改善血管内皮细胞功能及减轻炎性反应有密切关系。

[关键词] 灯盏乙素乙酯； 中动脉结扎； 人脐静脉内皮细胞； 氧化应激； 炎性反应

Protective effect and mechanism of scutellarin ethyl ester on focal

cerebral ischemia induced by ligation of middle cerebral artery in rats

MA Xiaojing， WANG Lan， YIN Xiaojie， WANG Zhimin， LIU Xiaoqian， GONG Leilei，

CHEN Liangmian， LIANG Rixin*， GAO Huimin*

（Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicine Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] To observe the protective effect of scutellarin ethyl ester on focal cerebral ischemia injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats（MCAOR）， and explore its mechanism. Totally 84 male SD rats were randomly divided into seven groups： shamoperated group， model group，positive drug group（niomdipine，12 mg·kg-1）， Brevisapin tablets group（48 mg·kg-1）， and high， middle and lowdose scutellarin ethyl ester groups（100， 50， 25 mg·kg-1）. The MCAOR model was prepared by using thread embolism method to observe the neurological function of rats， the area of cerebral infarction was measured with TTC， and the levels of MDA， SOD and NO in serum were detected with semiautomatic biochemistry analyzer.OxLDL and TNFα cell injury models was established by treating HUVECs with 200 mg·L-1 oxLDL and 100 μg·L-1TNFα，and the levels of MDA， SOD， NO， ET， 6ketoPGF1α，TXB2， IL1， IL6， IL8， ICAM1 and PECAM1 in the cell supernatant were determined. The results showed that scutellarin ethyl ester could effectively improve the neurological function of MCAOR rats， and significantly reduce the area of cerebral infarction. Compared with the model group， activities of SOD and NO in serum increased， while content of MDA decreased. In the cell supernatant， activities of SOD， 6ketoPGF1α and NO increased， content of IL1， IL6， IL8， ICAM1， PECAM1， TXB2， ET and MDA decreased， which indicated that scutellarin ethyl ester has a certain protective effect on focal cerebral ischemia injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats， and its mechanism may be related to antioxidative stress， improvement of endothelial function and reduction in inflammatory reaction.

[Key words] scutellarin ethyl ester； ligation of the middle cerebral artery； HUVEC； oxidative stress； inflammatory reaction

缺血性腦血管病是严重威胁人类健康的一种临床常见病[1]，在中医学中属中风病范畴。西医学主要以Ca2+拮抗剂，血管扩张剂及α肾上腺素受体抑制剂为主要治疗手段。中医学则采用血塞通，丹红注射液，灯盏花素，葛根素等活血益气药。灯盏花素是从菊科飞蓬属植物短葶飞蓬中提取的黄酮类有效成分，包括灯盏乙素和少量的灯盏甲素。药理研究表明，灯盏花素具有扩张血管，增加脑血流量，降低脑血管阻力及抗血小板聚集等作用；临床上主要用于脑中风后遗症的治疗[2]。但是，就目前上市的灯盏花素制剂来说，其注射剂半衰期短，消除速度快；而且，作为中风恢复期用药，患者多选择在家庭接受治疗，注射给药不认为是最佳给药途径。片剂虽然方便廉价，但存在生物利用度极低的问题。因此，如何对灯盏乙素开展前药设计，提高生物利用度是迫切需要解决的问题。课题组在前期工作中，引入前药设计理念，结合制剂学的考虑，合成了一系列灯盏乙素衍生物，发现其中的灯盏乙素乙酯（DZY02）对大鼠中动脉结扎所致的局灶性脑缺血具有保护作用，本文是在其药效学初筛的基础上，采用大鼠大脑中动脉结扎造成局灶性脑缺血模型，进一步观察了DZY02对脑缺血的保护作用；并采用OxLDL和TNFα诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型，从抗氧化和内皮细胞保护等角度，探讨了作用机制，旨在为灯盏乙素乙酯开发成为防治脑缺血的新药提供科学依据。

1 材料

1.1 动物及细胞株

SPF级SD大鼠，雄性，体重200～220 g，购自中国食品药品检定研究院，合格证号SCXK（京）20090017。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）由中国中医科学院中药研究所崔红玉惠赠。

1.2 药物及试剂

灯盏乙素乙酯（中国中医科学院中药研究所中药质量标准中心高慧敏研究员提供，批号140210）；尼莫地平购自天津市中央药业有限公司（批号130106）；灯盏花素片购自广东彼迪药业有限公司（批号20131101）；红四氮唑（TTC，美国Amresco试剂公司）；总超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号20131228）、丙二醛（MDA）测试盒（批号20131230）、一氧化氮（NO）测试盒（批号20140318）均购自南京建成生物工程研究所；Hyclone DMEM高糖培养基购自美国Thermo公司（批号NYK0997）；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司（批号130928）；0.25%胰酶购自美国Gibco公司（批号1155732）；DMSO（ACS级）购自美国Amereso公司；噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司；OxLDL购自北京协生生物技术有限公司（批号20140109，质量浓度1.32 g·L-1）；内皮素（ET）放免试剂盒（批号20150620）、6酮前列腺素1α（6ketoPGF1α）放免试剂盒（批号20150620），血栓烷素B2（TXB2）放免试剂盒（批号20150620）均购自北京北方生物技术研究所；白介素1（IL1）定量检测试剂盒（批号201607AO201701AC）、白介素6（IL6）定量检测试剂盒（批号 201607AN201701ZC）、白介素8（IL8）定量检测试剂盒（批号201607JD201701AT）均购自上海骞亿生物科技有限公司。MCAO栓线（北京沙东生物技术有限公司，编号2432A3100）。

1.3 仪器

SWCF2FD双人单面超净工作台（苏州净化设备厂）；MCO18AIC（UV）型CO2培养箱（日本SANYO公司）；CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；Varioskan Flash多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；GFD800半自动生化仪﹙山东高密彩虹分析仪器有限公司）。

2 方法

2.1 灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血的保护作用

2.1.1 分组与给药 84只大鼠随机分为7组，每组12只。假手术组及模型组给予等量蒸馏水；按体表面积法换算等量动物的等效剂量，阳性药尼莫地平组给予12 mg·kg-1；灯盏花素片组给予48 mg·kg-1；灯盏乙素乙酯组分高、中、低剂量组，分别为给予100，50，25 mg·kg-1。每日灌胃给药1次，连续12 d；术后各组再给药1次。DZY02药物配制：将DZY02与MCT（中链甘油三酸酯）混合并充分研磨至均匀后，加阿拉伯胶，并加入少量水，研磨，使之乳化成初乳，再逐渐加水稀释至全量，其中DZY02，MCT和阿拉伯胶比例为1∶2∶4。

2.1.2 大脑中动脉梗塞动物模型[3]（MCAO法） 大鼠用350 mg·kg-1的水合氯醛腹腔注射麻醉。颈部正中切口约2 cm，在一侧的肩胛舌骨和胸锁乳突肌形成的三角处暴露颈总动脉（CCA）及其分支颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。结扎ECA及其分支枕动脉、甲状腺上动脉及ECA终末支，分离ICA的分支翼突腭动脉。夹闭CCA，ICA及翼突腭动脉，将前端烧成0.3 mm小球的尼龙线自ECA切口插入，导入至ICA，松开ICA，继续插入尼龙线至其颅内段，当感到有明显阻力时，此时插入尼龙线距CCA分叉处约2 cm，即可阻断大脑中动脉（MCA）。假手术动物插线入1 cm，其余处理同模型。

2.1.3 神经功能评分[4] 在大脑中动脉结扎24 h，按Longa评分的5级4分法进行评分。0分：无明显神经功能缺损症状；1分：神经功能轻微缺损，不能完全伸展对侧前爪；2分：局灶性神经功能中度缺损，向对侧旋转；3分：局灶性神经功能重度缺损，行走时向对侧倾倒；4分：不能自行行走及昏迷。

2.1.4 脑梗死面积检测 大脑中动脉结扎后24 h，动物处死取脑，梗死部位切成2 mm厚片，放入已配好的TTC 5 mL染液瓶中，立即放入37 ℃水浴，20～30 min后取出染液瓶，弃染液，在原瓶内放入5 mL的10%甲醛，固定24 h，取出称重。脑切片染色后扫描（采用PhotoShop 6.0 软件测量像素，分析梗死面积[5]），计算脑重指数和梗死率。脑重指数=脑重/体重×100%；梗死率=梗死面积/全脑面积×100%。

2.1.5 MDA，SOD和NO检测 大脑中动脉结扎后24 h，腹主动脉采血5 mL，3 000 r·min-1离心15 min以分离血清，用于MDA，SOD和NO的测定。

2.2 灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血保护作用的机制研究

2.2.1 DZY02母液的配制 取DZY02粉末约1 mg，精密称定，溶于50 μL DMSO中，用不含血清的DMEM高糖培养基稀释至10 mL，超声2 h促进药物溶解，药物终浓度为100 mg·L-1。超声后用0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，实验时用不含血清的DMEM高糖培养基配成所需浓度，现用现配。

2.2.2 细胞培养 复苏的HUVECs，按4.0×104个/mL的密度接种于20 mm×100 mm培养皿中，加入10 mL的10%FBS DMEM培养基（含1×105 U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素，20 mmol·L-1的谷氨酰胺），置37 ℃，5%CO2培养箱培养。次日换液，2～3 d待细胞长至融合后，以0.25%胰酶EDTA消化按1∶3传代，细胞长至对数期用于实验。

2.2.3 OxLDL诱导HUVECs损伤模型建立及药物预处理 OxLDL以200 mg·L-1作用细胞24 h为造模条件。取生长状态良好的HUVEC细胞，以7.0×104 个/mL接种于96孔板，每孔0.1 mL，24 h细胞贴壁后，分为对照组、模型组、DZY02组（2.5，5，10 mg·L-1，无血清DMEM溶解，过滤除菌）；给药组DZY02预先干预24 h，对照组和模型组给予等量的无血清培养基。24 h后，吸弃上清，模型组和给药组加入终濃度200 mg·L-1OxLDL的培养基，对照组不做处理，各组均置37 ℃和5%CO2培养箱培养24 h，每个浓度设5个复孔。

2.2.4 TNFα诱导细胞损伤模型的建立及药物预处理 TNFα以100 μg·L-1作用细胞为造模条件。取生长状态良好的HUVEC细胞，以7.0×104 个/mL接种于96孔板，每孔0.1 mL，24 h细胞贴壁后，分为对照组、模型组、DZY02组（2.5，5，10 mg·L-1，无血清DMEM溶解，过滤除菌）；给药组DZY02预先干预24 h，对照组和模型组给予等量的无血清培养基。24 h后，吸弃上清，模型组和给药组加入终浓度100 μg·L-1TNFα的培养基，对照组不做处理，各组均置37 ℃和5%CO2培养箱培养24 h，每个浓度设5个复孔。

2.2.5 细胞存活率测定 模型处理结束后，吸出上清液，每孔加入200 μL培养基和50 g·L-1的MTT 20 μL孵育4 h，吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μL，摇床避光震荡15 min后用酶标仪检测吸光度（A），吸收波长为570 nm，每组设5个复孔。

2.2.6 MDA，SOD，NO/ET，6ketoPGF1α/TXB2，ICAM1，PECAM1及IL1，IL6，IL8的测定 模型处理结束后，吸出上清液，按试剂盒说明进行测定。

2.3 统计学方法

数据用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以±s表示，采用t检验（假手术组与模型组）或ANOVA单因素方差分析，组间比较方差齐时采用LDS，方差不齐时采用GamesHowell；有序资料采用Ridit分析，P<0.05为有统计学差异。

3 结果

3.1 灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血的保护作用

3.1.1 对脑缺血大鼠大鼠脑梗死体积及梗死率的影响 灯盏乙素乙酯高、中、低3个剂量组均明显降低脑缺血大鼠脑梗体积和梗死率，与模型组比较，具有显著性差异（P<0.05或P<0.01），见表1。

3.1.2 对脑缺血大鼠行为评分的影响 脑缺血大鼠行为学评分，模型组与假手术组比较，有显著性差异（P<0.01）；各给药组与模型组比较，也均有显著差异（P<0.05或P<0.01），提示灯盏乙素乙酯及阳性药均对脑缺血大鼠的行为学有明显的改善作用；而各给药组之间的神经行为学评分无显著差异，见表2。

3.1.3 对脑缺血大鼠血清SOD，MDA及NO含量的影响 灯盏乙素乙酯低剂量组提高SOD和NO活性，降低MDA含量，与模型组比较，有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；高、中剂量组对其没有影响，尼莫地平和灯盏花素提高SOD 活性，见表3。

3.2 灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血作用的机制研究

3.2.1 对OxLDL诱导HUVECs损伤的影响 与对照组比较，200 mg·L-1的OxLDL可明显降低HUVEC的存活率（P<0.01）。与模型组相比，DZY02组（2.5，5，10 mg·L-1）3个浓度可显著提高OxLDL诱导的HUVECs的存活率（P<0.05），见表4。

3.2.2 对OxLDL诱导HUVECs损伤细胞上清液中MDA和SOD含量的影响 与对照组相比，模型组MDA含量明显升高（P<0.01），SOD及NO含量降低（P<0.01）。药物处理组与模型组相比，DZY02组（2.5，5，10 mg·L-1）MDA含量显著降低（P<0.05），SOD及NO含量显著升高（P<0.05），见表5。

3.2.3 对OxLDL诱导HUVECs损伤细胞上清液中NO/ET，6ketoPGF1α，TXB2含量的影响 与对照组相比，模型组中ET，TXB2的含量明显升高（P<0.01），NO及6ketoPGF1α含量降低（P<0.01）。各药物处理组与模型组比较（2.5，5，10 mg·L-1），使ET，TXB2的含量显著降低，NO和6ketoPGF1α含量升高（P<0.01），见表6。

3.2.4 对OxLDL诱导HUVECs损伤细胞上清液中ICAM1和PECAM1的影响 与空白组比较，模型组ICAM1和PECAM1含量明显升高（P<0.01），与模型组相比，3个给药组（2.5，5，10 mg·L-1）能显著降低ICAM1和PECAM1的含量（P<0.05），见表7。

3.2.5 对TNFα诱导损伤的HUVECS存活率的影响 与空白组比较，100 μg·L-1的TNFα可明显降低HUVEC的存活率（P<0.001）。与模型组相比，经DZY02预先干预24 h后，2.5，5，10 mg·L-13个剂量均提高了HUVEC的存活率（P<0.05），并且随着药物剂量增加呈现一定的量效关系，见表8。

3.2.6 对TNFα诱导损伤的HUVECs分泌炎性因子的影響 与空白组比较，模型组的IL1，IL6，IL8含量明显升高（P<0.05），与模型组比较，DZY02组2.5，5，10 mg·L-13个剂量显著降低了IL1，IL6和IL8的含量（P<0.05），见表9。

3.2.7 对TNFα诱导损伤的HUVECs分泌ICAM1和PECAM1的影响 与空白组比较，模型组的ICAM1和PECAM1含量明显升高（P<0.01），与模型组比较，DZY02组2.5，5，10 mg·L-13个剂量显著降低了ICAM1和PECAM1的含量（P<0.05），见表10。

4 讨论

缺血性脑血管疾病（ICVD）是目前世界上致死率较高的疾病之一，主要由短暂性和持久性的局部

脑缺血引起，其发生和发展是多因素、多机制及多环节的恶性级联过程，可能与自由基损伤、炎性反应及血管内皮细胞损伤有关[6]。本文从行为学、形态学及生物标志物等方面证实了灯盏乙素乙酯对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用；并从抗氧化、炎性反应

和内皮细胞保护等角度，进一步证实了灯盏乙素乙酯对脑缺血损伤的保护作用可能与抗氧化应激，降低炎性反应及保护血管内皮细胞功能有关。

4.1 对MCAO损伤后大鼠神经功能缺损及脑梗死体积的改善作用

MCAO损伤是一种常见的临床病理生理过程，由此引发的脑肿胀，可引起神经功能障碍，并最终导致死亡[7]。大脑调节运动区域的血流主要由MCA提供，MCA阻断后该区域脑组织发生缺血性损伤，因此，MCAO损伤后大鼠出现神经功能障碍，表现为肢体肌无力，运动时向左侧旋转。本实验结果显示，灯盏乙素乙酯能够降低神经动能评分及脑梗死体积，提示灯盏乙素乙酯可以改善MCA大鼠的神经功能障碍，对脑缺血性损伤具有保护作用。

4.2 提高MCAO损伤后大鼠的抗氧化应激能力

脑缺血性损伤的发病机制涉及多因素，但主要与缺血本身直接攻击脑细胞，造成脑组织坏死，影响细胞内部的基因调控，诱导细胞凋亡有关，而这2个因素都与氧化应激密不可分。MDA是氧自由基引发的生物膜不饱和脂肪酸过氧化反应的代谢产物，反映了细胞损伤程度。SOD作为天然抗氧化剂，能够清除体内的氧自由基，其活性反映了机体清除氧自由基的能力[8]。本实验观察到，MCAO损伤模型组大鼠血浆MDA水平升高，SOD活性降低，说明脑缺血后机体氧自由基大量产生，而清除氧自由基能力障碍。灯盏乙素乙酯能够降低MDA水平，提高SOD活性和NO水平，表明其能够减轻脑缺血引起的氧自由基损伤，具有一定的抗氧化应激作用。

4.3 灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血作用的机制研究

缺血性损伤引起脑组织中钙超载，氧自由基（氧化应激）和炎性因子大量生成，三者之间可互相促进。在缺血性损伤发生后的数小时内，炎性因子表达的显著增加会引发脑组织损伤，从而导致氧自由基的产生[9]，过量的自由基通过破坏膜结构导致神经元死亡。神经细胞脂质膜的损伤使其通透性增加，又造成钙离子超载及促炎因子的大量释放，进一步加剧氧化应激过程。氧化应激和炎性反应互相促进，诱导细胞中凋亡基因表达，促使细胞凋亡，造成了脑组织缺血后连锁反应。缺血后的氧化应激和炎性反应是脑组织不可逆损伤的重要机制之一。因此，本文分别采用OxLDL和TNFα诱导损伤的HUVECs 模型，从抗氧化应激，血管内皮细胞保护和影响炎性反应的角度，探讨灯盏乙素乙酯的作用机制。

ET和NO是近几年发现的血管调节因子。ET具有强烈而持久的缩血管作用，而NO具有明显的扩血管作用，并抑制血小板聚集。正常状态下，二者的合成释放保持动态平衡，维持血管的正常舒缩功能，ICVD 的发生发展与这种平衡的破坏有关[10]。PGI2是血管内皮细胞合成释放的具有舒血管和抗血小板聚集作用的生物活性物质，而TXA2是促进血小板聚集和血管收缩的生物活性物质，两者由于半衰期短，分别迅速转化为6ketoPGF1α和TXB2[11]。正常生理状态下，PGI2和TXA2 保持动态平衡，调节血管的舒缩活动，防止血栓形成[12]。本文观察到，在OxLDL损伤状态下，HUVECs分泌NO和6ketoPGF1α减少，ET和TXB2分泌增多，NO/ET和6ketoPGF1α/TXB2比例失调，同时，MDA产生增多，SOD活性降低，表明氧化损伤能够导致内皮细胞功能紊乱并影响细胞内抗氧化活性物质的分泌。灯盏乙素乙酯作用于OxLDL损伤的HUVECs后，增加NO和6ketoPGF1α的释放，减少ET和TXB2的分泌，MDA产生减少，SOD活性升高，表明灯盏乙素乙酯对MCAO损伤后大鼠的保护作用可能与改善血管内皮细胞功能和抗氧化应激有关。

炎症反应在脑缺血损伤中起重要作用，在脑缺血早期炎症介质如IL1，IL6，IL8及TNFα等即可产生，是白细胞聚集，游出血管发挥细胞毒过程中的关键因素。白细胞聚集阻塞脑微血管，诱发血栓形成；游出的白细胞通过进一步释放炎性因子及氧自由基等直接损伤神经元及胶质细胞，进而加重，脑缺血后的继发性脑损害[13]。本文采用TNFα诱导损伤的HUVECs模型，探讨灯盏乙酸乙酯的作用机制，结果显示，TNFα诱导损伤的HUVECs模型组，IL1，IL6，IL8明显升高，灯盏乙酸乙酯降低IL1，IL6，IL8的释放，表明减轻炎性反应可能是灯盏乙素乙酯保护MCAO所致大鼠脑缺血损伤保护作用的机制之一。

ICAM1和PECAM1是免疫球蛋白超家族成员，与脑缺血后继发神经元损伤及炎性机制有密切关系。黏附分子的表达和活化是一个复杂而且高度调控的过程。多种介质，如氧自由基、TNFα等均可以上调黏附分子的表达[14]。在局灶性脑缺血炎性反应过程中，促进白细胞的活化、聚集、迁移及与血管内皮细胞黏附，进而通过各种机制，加重脑组织损伤。本文在OxLDL和TNFα誘导HUVECs损伤的实验中观察到，OxLDL和TNFα均升高ICAM1和PECAM1，与文献报道一致。灯盏乙素乙酯可以降低ICAM1和PECAM的分泌，表明黏附因子可能参与了灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血的保护作用。

综上所述，灯盏乙素乙酯对大鼠大脑中动脉结扎所致局灶性脑缺血具有良好的保护作用，其作用机制可能与抗氧化应激，改善血管内皮细胞功能及减轻炎性反应有密切关系。

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[责任编辑 张宁宁]