高产洛伐他汀的功能性红曲固态发酵营养液最佳pH值的研究

齐文武，陈晓云，郑世茂，庞 欣

(北京东方红航天生物技术股份有限公司，北京 101400)

高产洛伐他汀的功能性红曲固态发酵营养液最佳pH值的研究

齐文武，陈晓云，郑世茂，庞 欣

(北京东方红航天生物技术股份有限公司，北京 101400)

目的：研究功能性红曲固态发酵营养液的pH对洛伐他汀产量的影响。方法：基于现有的发酵工艺，设置了4个营养液pH梯度，分别为3.4、3.6、3.8和4.0，希望找到高产洛伐他汀的最佳pH条件。结果：当pH=3.6时，洛伐他汀含量相对较高，但是色价较低；当pH=3.4时，洛伐他汀的含量相对较低，但是色价较高，但仍然达不到功能性红曲米的要求，需在下一步的工作中继续改进。所有的处理条件下，均未检出桔青霉素。结论：功能性红曲固态发酵高产洛伐他汀的营养液最佳pH值为3.6。

功能性红曲；洛伐他汀；固态发酵；最佳pH；营养液

红曲霉的固体发酵产物红曲也称为红曲米，最早发明在汉代，在我国已有上千年的历史，可做药用和食用[1-2]。其中以明代李时珍所著《本草纲目》对红曲的记载最为完整，其性味甘、温，无毒，归肝、脾、胃、大肠经。红曲有健胃消食、活血化瘀等功效[3]。

1979年，日本科学家Endo等[3]从红色红曲霉的培养液中分离出活性物质红曲可林k，此发现引起多国专家学者对红曲霉进行了深入研究，取得了令人瞩目的成果。随着研究的深入，红曲霉中越来越多具有药用价值、营养价值的代谢产物被发现[4-5]。

发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产物的累积有很大的影响。在红曲发酵过程中，由于营养液的pH值会影响洛伐他汀的代谢过程，使洛伐他汀的产生量和产生比例发生改变，因此营养液的最适pH值一直受到研究人员的广泛重视。由于工业化生产管理相对比较宽泛，综合各项管理成本，营养液pH值一般设定为一个范围，而非一个精确的数值。随着pH检测设备由实验室逐步走进企业，使营养液pH的精确控制成为可能。

本研究针对红曲霉固态发酵过程中营养液pH 对洛伐他汀、桔青霉素含量和红曲色素的影响，探究在低或无桔青霉素基础上红曲霉固态发酵营养液的最佳pH培养条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 实验所用菌种为本公司制备保存的菌种，菌种编号：HT331511191111。

1.1.2 试剂及培养基材料 色谱级甲醇、无水乙醇、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏和大米粉等。

1.1.3 仪器设备 Waters高效液相色谱仪、双光束紫外分光光度计、分析天平、医用离心机、高速粉碎机、超声波清洗机、水浴锅、各种型号标准筛等。

1.2 发酵方法

1.2.1 接种 将保藏菌种进行扩大培养，接种于液体培养基，摇床培养72 h后接种于固体培养基。

1.2.2 培养基配制 液体培养基的物料按比例准确称量，混匀，250mL/瓶进行分装，121℃，灭菌20 min，备用；固体营养液的物料按比例准确称量，混匀，试验设4个处理，分别加入冰乙酸调节pH分别为3.4、3.6、3.8、4.0备用，做好标记；将配好的营养液加入按一定比例配好的大米粉混料中，充分混匀，进行分装，121℃、灭菌30 min，备用。

1.2.3 发酵、烘干、粉碎 经过高温发酵、低温发酵得到红曲。红曲经过烘干、粉碎、过筛、混匀、取样检测。

1.3 洛伐他汀含量测定方法(参照本公司企业标准)

1.3.1 色谱参考条件 色谱柱C185 μm×150 mm×4.6 mm；波长237 nm；柱温25℃；流速1.0 mL/min；流动相，甲醇∶水∶磷酸=850∶150∶0.4(体积分数)。

1.3.2 处理方法 样品全部经过100目标准筛，称取样品0.1～0.2 g，至8 mL的离心管，精密加入4 mL的75%乙醇超声处理60 min(温度50～70℃，15～20 min摇匀1次)，取出，3 000～4 000 r/min离心10 min，吸取上清液1 mL，置于8 mL刻度试管，加入0.5 mL的0.1mol/L 氢氧化钠-乙醇溶液，摇匀，静置10 min，加入0.5 mL的0.1mol/L 磷酸-乙醇溶液，摇匀，静置10 min，离心，取上清液 5μL，检测。

称取标准品10 mg，至50 mL的容量瓶，定容，混匀。吸取1 mL标准液，置于8 mL刻度试管，加入0.5 mL的0.1mol/L 氢氧化钠-乙醇溶液，摇匀，静置10 min，加入0.5mL的0.1mol/L 磷酸-乙醇溶液，摇匀，静置10 min，离心，取上清液5 μL，检测。

1.3.3 计算公式 样品含量计算公式如式(1)：

(1)

1.4 红曲粉中红色素含量测定

1.4.1 测定条件 紫外分光光度计波长505 nm、10 mm比色皿。

1.4.2 测定方法 参照《GB 1886.19-2015》[6]，样品全部过60目标准筛，准确称取红曲粉0.2 g，置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，60±0.5℃水浴中，准确浸泡1 h，冷却并定容，摇匀，过滤，备用，以色价高低表示红色素含量高低。以70%乙醇作为参比溶液，于紫外分光光度计上测定吸光度A值。

1.4.3 计算公式

(2)

式(2)中：X——红曲粉样品的色价(u/g)；A——样品浸泡液的吸光度；m——取样红曲粉的质量(g)。

1.5 桔青霉素的测定

桔青霉素的测定依据《GB/T5009.222-2008》[7]。

1.6 统计学方法

采用SPSS11.0软件进行统计分析，各组数据采用方差分析方法，P<0.05认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同pH对红曲发酵产物的影响

由图1—4的图谱的峰形基本一致，表明同一菌种发酵得到的红曲粉，尽管固体营养液的pH值不同，但发酵产物除洛伐他汀含量不同外，其他成分基本一致，说明营养液pH在 3.4～4.0的范围内，对发酵产物的组分没有显著影响，但洛伐他汀的产生量有所不同。

图1 pH=3.4时洛伐他汀含量图谱

图2 pH=3.6时洛伐他汀含量图谱

图3 pH=3.8时洛伐他汀含量图谱

图4 pH=4.0时洛伐他汀含量图谱

2.2 营养液pH对洛伐他汀含量的影响

为了保证数据的可靠性，完全相同的实验设计共进行了2次，每次4个处理、3个重复。将2次结果取均值，采用SPSS11.0软件进行统计分析。结果表明，不同pH值的营养液对洛伐他汀的含量有显著性差异。 pH 3.6的营养液处理后的样品中洛伐他汀含量显著高于3.4、3.8和4.0等3个不同pH值处理的样品(P<0.05)，其中以pH 3.6处理后的样品中洛伐他汀的含量最高，pH 3.4处理后的样品中洛伐他汀含量最低。

图5 不同pH对红曲产洛伐他汀的影响

2.3 营养液pH对色价的影响

图6表明，该工艺条件下，pH在3.6～4.0区间，色价处于一个较低的水平，而且色价的合成曲线与洛伐他汀含量曲线呈现相反的趋势。这与他人研究的洛伐他汀的产生会抑制红曲色素的生成结果相一致[8]。

图6 色价检测曲线

2.4 营养液pH对发酵产物桔青霉素含量的影响

从附表可以看出，pH在3.4～4.0的范围内桔霉素均未检出，为今后工艺改进创造了良好的前提条件。

附表 不同pH对红曲产桔青霉素的影响

3 讨论

红曲具有辅助降血脂的功能，是目前国家食品药品监督管理局批准的原料之一，红曲作为重要的保健食品原料已开发出多种产品。红曲的固体发酵在我国已有上千年的历史，发酵菌种繁多，发酵工艺各异。同一菌种，不同发酵工艺对发酵产物有何影响均需仔细研究。一方面提高目的产物的含量可以有效节约成本，另一方面改变发酵工艺是否会改变其他代谢产物的产出，甚至是否会产生有害的桔青霉素，是更加值得我们重视的问题。

工业上主要采用红曲霉固态发酵的方式生产洛伐他汀，培养基和培养条件对洛伐他汀的产量影响很大，当培养条件不适时，洛伐他汀的产量极微，甚至不产生[9-10]。因此，要想提高洛伐他汀的产量，需从优化培养条件入手。大工业生产中，考虑到人工、生产成本等因素通常采用pH试纸测定营养液的pH，固体营养液的pH一般控制在3.4～4.0之间，范围较宽。不同的pH值会导致每批洛伐他汀的产量不同，因此，在工业生产中进一步精确控制营养液的pH，对提高洛伐他汀的生产水平，降低成本生产意义重大。随着pH测试笔在生产中的广泛应用，使精确控制营养液pH 值成为可能。本研究对营养液的pH进行了优化，确定了营养液的最佳pH，在最佳pH条件下，洛伐他汀的产量较高，且发酵过程中无桔青霉产生，这为工业上红曲霉固态发酵产洛伐他汀提供了思路。

令人遗憾的是，该菌种在该工艺条件下，红曲色素含量太低。《GB 1886.19—2015》[6]对功能性红曲粉的色价要求是大于等于1 000，而本试验中红曲粉色价在100左右，虽然随着pH的变化有所变化，但远远不能满足工业化生产对红曲色素含量的要求。红曲色素为红曲霉发酵产生的天然色素，符合食品着色剂“天然、营养、多功能”的发展方向，具有很好的应用前景[11-12]，如何通过改良菌种或改善代谢条件，得到洛伐他汀和红曲色素均高产的工艺值得研究。◇

[1]杨萌，吴振强，梁世中. 功能性红曲的研究现状及前景预测[J].现代食品科技，2007，23(3)：95-97.

[2]李东，刘源，谢静，等. 红曲的起源、分类学及生药学鉴定[J].中国药业，2009，18(3)：1-2.

[3]Endo A，Monacolin K.A new hypochole-sterolemic agent produced by a MonascusSpecies [J]. Antibiotics，1979，32(8)：852-854.

[4]江利香，葛 锋，刘 畅. 红曲洛伐他汀的高产策略[J]. 中草药，2011，42(7)：1446-1452.

[5]张徐兰，吴天祥，李鹏. 红曲霉有效成分应用研究进展[J]. 酿酒科技，2006(9)：78-80.

[6]GB 1886.19-2015.食品安全国家标准 食品添加剂 红曲米[S].

[7]GB/T 5009.222-2008.红曲类产品中桔青霉素的测定[S].

[8]廖南清.群感效应对红曲霉洛伐他汀和红曲色素合成的影响及调控机制研究[D]. 广州：广东药学院，2015.

[9]欧阳泽智. 红曲霉荞麦的固态发酵及其产物降血脂作用的研究[D].延边：延边大学，2012.

[10]Ajdari Z，et al. Nutritional Requirements for the Improwement of Growth and Sporulation of Several Strains of Monascuspurpureus on Solid State Cultivation[J].Journal of Biomedicine and Biotechnology，2012(2011)：1-9.

[11]蒋冬花，孙蕾，陈璨，等. 高产色素红曲霉菌株的筛选、鉴定和固体发酵条件优化[J].浙江农业学报，2015，27(9)：1639-1645.

[12]陆磊，刘秀河.功能性红曲米发酵工艺与控制[J]. 山东食品发酵，2013(4)：9-11.

(责任编辑 李婷婷)

The Optimum pH Value of Functional Solid Fermentation of Monascus Nutrient Solution for Best Yield of Lovastatin

QI Wen-wu， CHEN Xiao-yun， ZHENG Shi-mao， PANG Xin

(Beijing Dawn Aerospace Bio-tech CO.LTD，Beijing 101400，China)

functional monascus；lovastatin；solid-state fermentation；optimum pH；nutrient solution

齐文武(1988— )，男，学士，研究方向：保健食品与食用菌开发。

庞欣(1970— )，女，博士，研究方向：保健食品与食用菌开发。