几种甘肃特色中药提取液对羊肚菌菌丝生长的影响

韩融冰 赵玉卉 路等学 王 龙 秦 鹏

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

羊肚菌（Morchella sp.）是一种野生食用菌，又名美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌等，是子囊菌亚门（Ascomycotina）中著名的食用菌，具有很高的营养和药用价值，风味鲜美，深受国内外消费者的喜爱[1，2]。羊肚菌在我国主要分布于甘肃、四川、陕西、云南等地[3]。《中华本草》记载：羊肚菌消食和胃，化痰理气，主治消化不良，痰多咳嗽，还有防癌抗癌、预防感冒、增加人体免疫力的效果[4]。现代药理学研究表明，羊肚菌生物活性有效组分多糖的含量很高，其子实体多糖和液态深层发酵培养过程中产生的菌丝体多糖入药有消积杀虫的作用，增强人体免疫功能，还具有抗病毒、抗肿瘤作用，且能降低胆固醇含量，防止动脉硬化等功效[5]。由于羊肚菌栽培条件复杂，商品化栽培生产还难以实现，目前液体发酵成为利用该菌的重要途径[1]。研究表明，由于中草药中的成分（生物碱、皂苷、黄酮等）可促进或抑制药用真菌菌丝体的生长及代谢产物的产生[6]。笔者通过比较4种甘肃特色中药甘草、当归、党参、板蓝根提取液对羊肚菌菌丝生长的影响，筛选出有明显促进作用的中药种类和添加浓度，可为大规模培养羊肚菌菌丝体、并提取羊肚菌多糖提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料①菌种：羊肚菌4#，购自四川绵阳食用菌研究所。②中药：甘草、当归、党参、板蓝根（药材级），购自甘肃德生堂大药房。③培养基PDA：马铃薯（去皮）20%，葡萄糖2%，琼脂2%，用于添加量筛选试验。液体培养基：玉米粉（煮汁）1%，黄豆粉（煮汁）0.5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%。用于液体培养验证试验。

1.2 试验方法

1.2.1 中药提取液的制备[7]称取100 g中药，在500 mL水中浸泡1 h后用烧杯文火煎煮30 min，用四层纱布滤出药汁，再在药渣中加300 mL水煎煮，滤出药汁，将两次滤出的药汁混合并定容至500 mL，备用。

1.2.2 中药液添加浓度筛选试验 将4种中药提取液加入PDA培养基中，配置成6个质量浓度的培养基，提取液为25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL、150 mg/mL，空白对照组为不加中药提取液的基本PDA培养基，制平板，每个处理5个平行。将活化培养（PDA平板培养基上，25℃培养3～4 d）的羊肚菌菌丝体块（直径6 mm）接于各处理组和对照组平板中，25℃、避光培养，定期观察菌丝生长势。如未筛选出理想的中药浓度，则根据试验的具体情况重新设定中药提取液的浓度范围。

每个中药提取液选取促进羊肚菌生长的两个最佳添加浓度进行摇瓶培养试验。

1.2.3 液体摇瓶培养验证 将菌种接入液体培养基中（接种块的大小、厚薄以菌种块浮在液面不沉下去为宜），25oC恒温静置培养2～3 d，待菌丝萌发后，25℃，160 r/min振荡培养7 d，制得羊肚菌液体菌种，备用。

根据平板上筛选出的最佳中药提取液浓度范围，在无菌条件下抽取30 mL制备好的羊肚菌液体菌种，接种到装有添加中药提取液的液体培养基（300 mL）的500 mL的三角瓶中，空白对照组不加中药提取液。每组3个平行，25℃，160 r/min振荡培养，以培养液清澈结束培养，测定生物量[8]，以确定不同中药提取液添加的最佳浓度。

1.2.4 菌丝体特征观察 将转接了菌丝体块的各组平板置于25℃、避光条件下恒温培养，定期观察菌丝生长势，以菌丝即将长满而未长满平皿时作为测量终点，记录培养天数，以接种块为中心用刻度尺测量菌落直径（mm），随机测量3次，取平均值。计算菌丝日均长速[7]：

1.2.5 菌落干重测定[7]菌丝体培养到第7天时，将平板中的菌丝体连同培养基一并取出，放入盛有蒸馏水的搪瓷量杯中，每个平板对应一个量杯，然后将量杯放在电磁炉上加热，直至培养基完全液化，用玻璃棒挑出菌丝，并在加热的蒸馏水中漂洗几遍，取出后用滤纸吸去多余水分，置于电热鼓风干燥箱中105oC烘至恒重后称重。

1.2.6 摇瓶培养菌丝体生物量的测定[8]将发酵液移入离心管中在高速离心机4000 r/min离心30 min，把离心管底部的沉淀物用小勺移入180目的滤布中，用蒸馏水反复冲洗后将菌丝体移入培养皿中，再置于电热鼓风干燥箱中105oC烘至恒重后称重[8]。

2 结果与分析

表1 不同质量浓度甘草提取液对羊肚菌菌丝体生长的影响

2.1 不同质量浓度甘草提取液对羊肚菌菌丝体生长的影响由表1可知，与对照相比，不同质量浓度的甘草提取液对羊肚菌菌丝体生物量的积累有促进作用，在25～125 mg/mL，随提取液添加质量浓度的上升，虽然菌丝体生长速度逐渐变慢，但菌丝体生长密度逐渐增大，长势旺盛，菌丝体生物量积累明显增加，其中添加甘草提取物质量浓度为125 mg/mL和150 mg/mL时效果最明显，菌落干重分别达到191 mg和183 mg。

2.2 不同质量浓度当归提取液对羊肚菌菌丝体生长的影响由表2可知，与对照相比，不同质量浓度的当归提取液对羊肚菌菌丝体生长有促进作用，在25～125 mg/mL，随质量浓度的增加，菌丝体生长速度逐渐变缓的同时菌丝体生长密度逐渐增大，长势旺盛，得到的菌落干重也相应增加，其中甘草提取物添加质量浓度为125 mg/mL和150 mg/mL时效果最明显，菌落干重分别达到248 mg和231 mg。

表2 不同质量浓度当归提取液对羊肚菌菌丝体生长的影响

2.3 不同质量浓度党参提取液对羊肚菌菌丝体生长的影响由表3可知，与对照相比，不同质量浓度的党参提取液对羊肚菌菌丝体生长有促进作用，在25～125 mg/mL，随着浓度的增加，菌丝体生长速度逐渐变慢的同时菌丝体生长密度逐渐增大，长势旺盛，得到的菌落干重也相应增加。其中党参提取物质量浓度为100 mg/mL和125 mg/mL时效果最明显，菌落干重分别达到177 mg和193 mg。

表3 不同质量浓度党参提取液对羊肚菌菌丝体生长的影响

2.4 不同质量浓度板蓝根提取液对羊肚菌菌丝体生长的影响与对照组相比，试验设计6个处理对羊肚菌菌丝体的生长速度及生物量累积均有不同程度抑制作用，且随着浓度不断增加，抑制效果越明显，所以重新选取5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL的板蓝根提取液进行适宜质量浓度筛选试验。结果见表4。

由表4可知，选较低质量浓度的板蓝根提取液对羊肚菌菌丝体生长有一定促进作用，与对照相比，各处理组的菌丝体生长速度相对要慢，而菌丝体生长密度，在提取液浓度低于15 mg/mL时有所增加。板蓝根提取物添加质量浓度为5 mg/mL和10 mg/mL时效果相对较好，菌落干重分别达到121 mg和135 mg。

表4 不同浓度板蓝根提取液对羊肚菌菌丝体生长的影响

表5 不同中药提取液对羊肚菌液体培养菌丝体生长的影响

2.5 验证试验结果分别选取上述筛选出的各中药提取液最佳添加量进行液体培养试验，结果见表5。

由表5可知，与对照相比，添加4种甘肃特色中药提取液后，羊肚菌液体培养所需天数（培养液清澈计天数）有所增加，但生物量积累大幅度提高，其中当归的效果最佳，当添加质量浓度为125 mg/mL时，羊肚菌菌丝生物量相比对照组增加110%，达到1.03 g/mL；其次是党参和甘草，当添加质量浓度分别为125 mg/mL时，生物量分别增加69.4%和57.1%，达到0.83 g/mL和0.77 g/mL；板蓝根效果相对较差，当添加质量浓度为10 mg/mL时，生物量增加32.7%，达到0.65 g/mL。

3 小结与讨论

4种供试中药提取液对羊肚菌菌丝体生长速度有不同程度抑制作用，但对羊肚菌菌丝体生物量的积累有明显的促进作用，其中当归效果最明显，添加质量浓度为125 mg/mL时，羊肚菌液体培养生物量积累最佳。

以深层培养的发酵液和菌丝为主要原料提取羊肚菌胞外、胞内多糖是羊肚菌多糖的重要来源之一[9]，羊肚菌发酵液中菌丝体生物量与胞外多糖产量呈正相关[10]。试验为甘肃特色中药在羊肚菌多糖生产应用提供参考。