葡萄籽原花青素对下肢动脉硬化闭塞症的效应研究

陆 磊，冯 超，崔学兵，杨继武，秦 燕，刘仁贵*

（1.大理大学第一附属医院外六科，云南大理 671000；2.大理大学基础医学院，云南大理 671000）

葡萄籽原花青素对下肢动脉硬化闭塞症的效应研究

陆 磊1，冯 超1，崔学兵1，杨继武1，秦 燕2，刘仁贵1*

（1.大理大学第一附属医院外六科，云南大理 671000；2.大理大学基础医学院，云南大理 671000）

目的：探讨葡萄籽原花青素（GSPE）对下肢动脉硬化闭塞症（LEASO）的防治作用，并初步探讨其作用机制。方法:新西兰雄性家兔30只，进行LEASO模型复制。随机分为正常对照组（CON组）、模型组（LEASO组）和GSPE干预组（GSPE组）（0.5 g/kg），每组10只。于术后第4、8、12周检测家兔血清TC（总胆固醇）及ox-LDL（氧化低密度脂蛋白）水平，第12周末检测SOD、MDA含量。分别在术前及术后12周对各组家兔行右后肢Doppler检查；第12周末行家兔双后肢DSA。结果：与CON组比较，LEASO组家兔有跛行，见右后肢足趾甚至右足坏疽，GSPE组的肢体活动基本正常，未见坏疽；与LEASO组比较，GSPE组血清ox-LDL水平在第8、12周均明显降低（P＜0.05）；第12周末，血清SOD活性升高的同时MDA下降（P＜0.05）。Doppler显示GSPE组家兔股浅动脉远端PV值较LEASO组明显升高（P＜0.01）；DSA显示GSPE组家兔右后肢股浅动脉仅呈节段性闭塞，远端血管显影良好，有侧支循环建立。结论：GSPE对LEASO具有一定的防治作用，其机制可能是通过清除自由基、降低脂质过氧化水平等途径实现的。

GSPE；下肢动脉硬化闭塞症；抗氧化；防治作用

下肢动脉硬化闭塞症（lower extremity arterio⁃sclerosis obliterans，LEASO）是一种常见的慢性肢体缺血性疾病，动脉粥样硬化是其发病的基础。随着人类社会的发展和进步，人类饮食习惯和结构发生改变，生活质量提高，人均寿命延长，社会老龄化越来越明显，LEASO的发病率也有明显升高〔1〕。研究表明LEASO是一种以血管壁中脂质和蛋白质氧化为特征的高氧化应激状态〔2〕。据此，有效清除氧自由基、抑制脂质过氧化水平就有可能减缓甚至阻止动脉硬化的发生。

葡萄籽原花青素（GSPE）是一种多酚化合物，具有多种生物学活性，尤其是它强大的抗氧化作用。本研究在成功建立实验动物模型的基础上观察GSPE对下肢动脉硬化闭塞症的防治效果并探讨其机制，为该疾病的药物治疗寻找新的突破点。

1 材料与方法

1.1试剂、药品超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、一氧化氮（NO）试剂盒，丙二醛（MDA）试剂盒、考马斯亮兰检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；GSPE（西安小草植物科技有限责任公司），其他均为常用化学试剂。严格按照试剂盒说明由专人进行各指标的检测。

1.2实验仪器及设备T6紫外分光光度计（北京普析）；18R高速冷冻离心机TGL-18R（珠海黑马医学仪器有限公司）；全自动生化分析仪H7180型（日本日立）；Terason T3000便携式彩色超声多普勒仪（美国GE）；Allura CV20型数字减影血管造影X线机（荷兰飞利浦）。

1.3分组及处理新西兰雄性家兔30只，体重1.90～2.10 kg（大理大学动物实验中心提供）。适应性饲养3 d后随机分为正常对照组（CON组）、下肢动脉硬化闭塞症模型组（LEASO组）及葡萄籽原花青素干预组（GSPE组），每组10只。CON组给予常规标准饲料，而LEASO组及GSPE组给予高脂饲料喂养。同时，GSPE组给予5%GSPE混悬液灌胃（0.5 g/（kg·d）），连续12周，而CON组和LEASO组给予同体积的生理盐水灌胃。

1.4动物模型的制备高脂饲料喂养2周后，对LEASO组及GSPE组进行造模。20%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉家兔后，于腹股沟区解剖右股动脉，结扎其侧支及股深动脉，在快速阻断股动脉血流后在股动脉前壁剪开一小口，向远端插入2F Fogarty球囊导管直至膝关节处，扩张球囊之后来回拖动导管5次破坏股浅动脉内膜，7-0血管缝合线缝合股动脉切口。术后给予青霉素G肌注（40 000 U/kg），连续3 d。

1.5指标检测

1.5.1 血清TC、ox-LDL水平测定 造模后第4、8、12周于家兔耳缘静脉采血检测血清总胆固醇（TC）及氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，由全自动生化分析仪检测。

1.5.2 血清NO、SOD及MDA含量的检测 第12周末自家兔下腔静脉取血4 mL，4 500 r/min，离心10 min，保留血清备用。分别在550、630及532 nm波长处测定血清NO、SOD、MDA的含量。

1.5.3 血管彩色超声多普勒探测 造模前及造模12周后分别对3组家兔行后肢血管彩色超声多普勒检查，检测后肢股动脉血流情况，采集各组家兔后肢股动脉血流频谱图及峰值流速（peak systolic velocity，PV）。

1.5.4 肢体血管造影 造模12周末，行后肢动脉造影。观察双侧股动脉血流情况，采集各组家兔后肢动脉造影图。

1.6统计学处理数据采用SPSS 11.5统计软件进行分析，结果用（均数±标准差）进行统计描述，采用方差分析进行三组间差异性比较，若差异具有统计学意义采用SNK法进行两两比较，检验水准定为0.05。

2 结果

2.1各组家兔血清TC水平与CON组比较，LEASO组和GSPE组血清TC水平于第4周明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。之后该两组的血清TC水平持续维持于高水平。GSPE组的TC水平在第4、8、12周与LEASO组比较，无明显差异，不具有统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各组家兔血清TC水平的变化（mmol/L，

表1 各组家兔血清TC水平的变化（mmol/L，

注：与CON组比较▲P＜0.05；与LEASO组比较★P>0.05。

组别0周4周8周12周CON组1.38±0.21 1.41±0.17 1.37±0.36 1.52±0.48 LEASO组1.42±0.27 23.98±1.16▲24.27±1.03▲24.52±1.97▲GSPE组1.32±0.35 24.11±1.24★▲23.91±1.67★▲24.27±1.16★▲

2.2各组家兔血清ox-LDL水平与CON组比较，LEASO组血清ox-LDL水平于第4周开始升高，第8及第12周呈明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；GSPE组血清ox-LDL水平于第8及12周明显低于LEASO组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组家兔血清ox-LDL水平的变化（mmol/L

表2 各组家兔血清ox-LDL水平的变化（mmol/L

注：与CON组比较★P＜0.05，与LEASO组比较▲P＜0.05。

组别0周4周8周12周CON组20.47±1.23 21.84±3.01 24.06±4.58 22.48±3.23 LEASO组21.03±1.82 26.21±2.41★50.31±6.21★56.27±4.36★GSPE组20.87±2.33 25.11±1.32★41.23±5.86★▲44.39±5.61★▲

2.3各组家兔血清NO、SOD、MDA含量与CON组比较，LEASO组、GSPE组造模12周后血清SOD活性及NO水平明显降低，而MDA的含量升高（P＜0.05）；与LEASO组比较，GSPE组血清SOD活性及NO水平明显上升，同时MDA的含量下降（P＜0.05）。见表3。

表3 各组家兔12周末血清MDA、SOD、NO含量的变化（

表3 各组家兔12周末血清MDA、SOD、NO含量的变化（

注：与CON组比较★P＜0.05；与LEASO组比较▲P＜0.05。

组别MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）NO/（nmol/mL）CON组LEASO组2.89±0.13 8.31±0.26★125.65±2.18 53.41±3.85★82.14±10.71 25.24±3.43★GSPE组7.68±0.42★▲89.88±2.11★▲37.28±2.62★▲

2.4各组家兔肢体血管彩色超声多普勒探测结果显示，实验前各组家兔后肢股动脉远端峰值流速（PV）值无明显差异。造模12周后测定各组右后肢股动脉远端PV值，GSPE组及LEASO组的股动脉远端PV值较CON组明显降低，差异明显，有统计学意义（P＜0.05）；而与LEASO组比较，GSPE组家兔股动脉远端PV值是其2倍以上，呈明显的升高（P＜0.05）。见表4。

表4 各组家兔右后肢股动脉远端峰值流速PV值（cm/s）

2.5各组家兔肢体血管造影各组家兔DSA结果显示：CON组双侧股浅、股深动脉正常显影；LEASO组右股深、浅动脉完全性闭塞，远端无明显血流，无明显侧支循环形成；GSPE组显示股深动脉未见显影，手术部位以下的右股浅动脉节段性闭塞，但远端动脉显影良好，并可见丰富的侧支循环形成。见图1。

图1 各组家兔肢体血管造影图

3 讨论

动脉粥样硬化是一可累及全身血管的弥漫性病变，LEASO是在全身性动脉粥样硬化基础上的肢体表现，越来越多的临床和实验研究表明动脉粥样硬化的进展以多种不同的方式进行，无论从结构还是生物学观点，都表现为一种动力学进程。国外报道40岁以后，每10年该病的发病率可增高2～3倍，55岁以上人群约有20%有不同程度的动脉硬化闭塞并可引发临床症状〔1〕。目前，动脉硬化闭塞症的病因不十分清楚，血管细胞、血细胞和脂蛋白之间的相互作用十分重要并掺杂其中。新近的研究显示LEASO表现为一种高氧化应激状态，以血管壁中脂质和蛋白质氧化为特征〔2〕，在此病理过程中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）诱导的氧化应激扮演了重要角色〔3〕，ROS不仅氧化修饰低密度脂蛋白，促进泡沫细胞形成，而且其介导的脂质过氧化可破坏血管内皮细胞，致其功能障碍，从而促进动脉硬化的发生发展〔4-5〕。据此，笔者认为减少ROS的生成，减轻脂质的过氧化反应，就能减轻或抑制LEASO的发展。

GSPE极强的抗氧化及清除自由基的活性已得以证实，其在体内的抗氧化活性是维生素C的20倍，维生素E的50倍〔6〕。除其直接抗氧化作用外，它还可通过降低内外源性的氧化应激、保护内源性抗氧化物质而起到抗氧化损伤作用。此外，GSPE亦可捕获水溶性物质（例如血清、动脉壁间质液等）中的ROS，清除自由基，抑制LDL（低密度脂蛋白）的氧化，发挥抗动脉硬化的作用〔7-8〕。如果GSPE通过清除氧自由基的生成，减轻脂质的过氧化反应，也就有可能减轻或抑制LEASO的发生发展进程。

本实验通过饲喂家兔高胆固醇饲料及行球囊导管损伤血管内膜，成功建立LEASO的动物模型，同时给予GSPE进行干预。实验结果显示：造模第4周LEASO组及GSPE组血清TC水平均已明显升高，之后一直维持在较高水平，与CON组比较均有显著性差异（P＜0.05），表明高脂血症的模型复制成功。但是GSPE组与LEASO组比较，两组间则没有差异，表明GSPE对血清血脂水平几乎没有影响，这一结果与部分文献的报道相一致。然而，我们却观察到，GSPE组从第8周开始，血清ox-LDL水平有明显下降，且整个实验过程中，血清ox-LDL水平一直低于LEASO组，两者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。ox-LDL由血浆中的LDL经过氧化修饰形成，是粥样斑块的特征性成分之一。ox-LDL能促使巨噬细胞吞噬大量脂质而成为泡沫细胞，而粥样斑块的主要成分正是泡沫细胞累积而成的脂质核心，并且ox-LDL具有高度的细胞毒性，可损伤血管内皮细胞，促进动脉硬化的发生与发展，是LEASO形成过程中的重要中介因素〔9-10〕。因此，GSPE抑制了血清LDL的氧化修饰，就能减缓或阻抑动脉硬化闭塞症的发生与发展，从而有利于改善LEASO组家兔肢体的缺血症状。

家兔血清SOD活性，NO含量及MDA含量的测定显示：GSPE组SOD活性、NO水平明显升高，高于LEASO组，与此同时MDA含量明显降低，差异明显，具有统计学意义（P＜0.05）。SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损害，SOD活性的高低间接反应机体清除氧自由基的能力；MDA是脂质过氧化的最终产物，可破坏细胞膜结构，引起细胞功能障碍，甚至死亡，其含量可反映机体内脂质过氧化的程度。实验结果表明，GSPE有较强的清除氧自由基、减轻脂质过氧化反应的能力。正是由于GSPE的抗氧化作用，致使血清ox-LDL水平明显低于LEASO组。影像学的资料也显示：第12周，GSPE组家兔右后肢股动脉远端峰值流速（PV）值较LEASO组明显升高，是其2倍以上，说明GSPE干预后家兔右后肢缺血情况有了明显改善；DSA则更直观地显示了GSPE组股动脉出现部分再通，远端动脉显影及丰富的侧支循环建立，较LEASO组有了明显改善。在实验过程中也同时观察到CON组家兔正常进食及活动，LEASO组家兔进食尚可，但活动明显减少，有跛行现象，右后肢皮温明显降低，并可见右后肢足趾坏疽甚至右足坏疽。而GSPE组家兔与CON组家兔一样正常进食及活动，无跛行，未见足趾坏疽，这些表现与上述影像学结果是相一致的。

综上所述，GSPE干预能有效改善LEASO肢体的缺血症状，促进侧支循环的建立，从而阻止或减缓LEASO的发生和发展，对该病表现出良好的防治效果，目前国内外尚未见相关研究及报道。其机制可能与其强大的抗氧化作用（如清除氧自由基、降低脂质过氧化水平等）有关，GSPE能否直接或间接促进侧支循环的建立，则有待进一步的证实。

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Protective Effectof Grape Seed Proanthocyanidin Extracton Lower Extremity Arteriosclerosis Obliterans

Lu Lei1,Feng Chao1,Cui Xuebing1,Yang Jiwu1,Qin Yan2,Liu Rengui1*
（1.DepartmentofGeneral Surgery,The First Affiliated Hospitalof Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the protective effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract（GSPE）on lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO）,and to preliminarily explore its action mechanism.Methods:30 male New Zealand rabbits were randomly divided into three groups with 10 animals each to duplicate LEASO model.They were normal control group（CON group）, LEASO model group,and GSPE group（0.5 g/kg）.The TC and ox-LDL in serum were assayed after operation for 4 th,8 th and 12 th week.At the end of 12th week,the contentof SOD and MDA were detected.The right posterior femoral artery blood flow was detected by color doppler ultrasound,and digital subtraction angiography（DSA）of the double posterior limbs in rabbit was conducted before the operation and after 12th week.Results:Compared with CON group,rabbits of LEASO group had claudication and thanatosis was found in both posterior limbs.GSPE group showed normal activity without thanatosis.Compared with LEASO group,GSPE group's serum ox-LDL level decreased significantly at the end of 8th,12th week after operation（P＜0.05）.The activity of serum SOD raised obviously while MDA decreased significantly（P＜0.05）.Compared with LEASO group,GSPE group showed higher PV of right posterior superficial femoral artery under the detection of color doppler ultrasound（P＜0.01）.Detection of digital subtraction angiography（DSA）showed that the distal vascular imaging of right posterior superficial femoral artery was good in GSPE group and visible abundant collateral circulation was established.Conclusion:GSPE had a prominent protective effect on LEASO via removing free radicals,reducing lipid peroxidation level,etc.

GSPE;lower extremity arteriosclerosis obliterans;antioxidation;protective effect

R285.5

A

2096-2266（2017）04-0036-05

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.010

（责任编辑 李 杨）

云南省教育厅科研基金资助项目（0900158）

2016-04-29

2016-12-29

陆磊，硕士研究生，主要从事普外基础与临床研究.

*通信作者：刘仁贵，主任医师.