PHA产生菌的筛选与鉴定

何宗均+田阳+梁海恬

摘 要：从15个污泥样品中分离筛选出5株PHA产生菌，其中A-0603-11为产PHA最好菌株，经苏丹黑染色镜检发现有2～3个PHA颗粒，黑色部分的体积占菌体50%以上。生理生化试验表明，该菌为革兰氏阴性杆状，单鞭毛运动，好氧，氧化酶阳性，接触酶阳性，不发酵D-葡萄糖和其它糖类。经分子生物学鉴定，该菌为Delftia sp.，属于Comamonadaceae丛毛单胞菌科。

关键词：PHA；菌株；筛选；鉴定

中图分类号：Q93-331 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.04.006

Screening and Identification of PHA Producing Bacteria

HE Zongjun， TIAN Yang，LIANG Haitian

（Tianjin Institute of Agriculture Resources and Environmental Science， Tianjin 300192， China）

Abstract： A test was conducted in that 5 PHA producing bacterium strains isolated from 15 samples of sludge， and the A-0603-11 strains was the best for PHA production among them. By microscopy with staining on Sudan black dye， the A-0603-11 strains was found that they had two or three particles of PHA， and the black part volume accounted for over 50% of the bacteria. The physiological and biochemical experiments showed that the bacteria was in gram-negative rods， single flagella， aerobic， not fermentation d-glucose and other sugars， and oxidase was positive. According to the molecular biology， the A-0603-11 bacteria was Delftia sp. and it was belong to the Comamonadaceae fetlock division of bacterium.

Key words： PHA；bacteria；screening；identification

PHA（聚羟基脂肪酸酯，Polyhydroxyalkanoate）是广泛存在于多种微生物及其它生物体内的一种细胞内涵物。PHA具有与化学合成塑料相似的物理机械特性，作为一种微生物合成的、性能类似于聚丙烯的可降解“塑料”而引起人们的关注。PHA在自然界中可降解，造成的环境污染小，是可再生的生物资源，有利于可持续发展，在很多领域有着较大的应用潜力。例如PHA材料具有类似塑料的物化性质，可以用作包装材料或者日常消费用塑料制品，用其替代现有的大规模使用的石油来源的不可降解塑料，将有助于解决“白色污染”等环境问题；PHA材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，在高附加值的细胞组织工程领域有很大的应用前景；PHA材料可作为生物可降解和生物相容性医用植入材料和可控藥物缓释载体；PHA作为一种胞内生物聚酯，是多种微生物（包括细菌、古细菌）在碳源过剩时储备能量和碳源的物质，PHA本身具有可燃性，可以用于制备生物燃料[1-20]。但是，PHA材料在农业中的应用研究却鲜有报道，因此，PHA材料在农业上的应用基础研究应该得到重视。基于以上考虑，本研究从农业可降解材料产生菌的角度出发，筛选PHA产生菌并进行初步的鉴定。

1 材料和方法

1.1 试验材料

筛选样品：4个排污口污泥样品和11个农村生活污水沟污泥样品。

初筛培养基：胰蛋白胨 2.5 g，酵母提取物2.5 g，葡萄糖5 g，蔗糖2 g，麦芽糖 2 g，甘露醇1 g，氯化钠5 g，琼脂粉 20 g，水100 mL，调pH值至6.5～7.0，121 ℃高压20 min，稍凉后，以体积比1∶100加入1%溴百里香酚蓝（称取1 g溴百里香酚蓝溶于100 mL 70%酒精中）倒制平板。

复筛培养基：胰蛋白胨1.5 g，酵母提取物1.5 g，葡萄糖10 g，蔗糖2 g，麦芽糖2 g，甘露醇1 g，氯化钠5 g，琼脂粉20 g，水100 mL，调pH值至6.5～7.0，121 ℃高压20 min，稍凉后，以体积比1∶100加入1%溴百里香酚蓝（称取1 g溴百里香酚蓝溶于100 mL 70%酒精中）倒制平板。

1.2 试验方法

1.2.1 PHA产生菌的初筛 取污泥样品5 g于250 mL锥形瓶，加入45 mL无菌水，加入少许玻璃珠，摇床振摇15 min。将土样悬液稀释101～106倍，取各稀释度100 μL涂布平板，30 ℃培养24～28 h。向平板中喷洒0.1%溴百里酚蓝指示剂（取1 g溴百里酚蓝，溶于1 L 20%乙醇溶液中），挑取菌落周围变蓝的菌落。将上述菌落用平板划线法接种于新的初筛平板（直接在培养基中加入0.01%溴百里酚蓝）上进行纯化分离。

1.2.2 PHA产生菌的复筛 挑取上述菌落在复筛平板上划线培养，挑取菌体涂片，固定，先用苏丹黑染色，二甲苯冲洗，再用蕃红二次染色2～3 min。晾干后用光学显微镜进行观察，选择有染色颗粒的菌落进行保存，即为PHA产生菌。

1.2.3 PHA产生菌的鉴定 16S rDNA测序，扩增V3区，PCR引物为27F和1429采用高保真DNA聚合酶，Fast Pfu。生理生化鉴特性测定方法参照《常见细菌系统鉴定手册》。

2 结果与分析

2.1 PHA产生菌筛选情况

如表1所示：从4个排污口污泥样品中分离出产碱菌株43个，其中产PHA菌株为1个；从11个农村生活污水沟污泥样品中分离出产碱菌株86个，其中产PHA菌株为3个。从15个样品中共分离筛选出4株PHA产生菌株。对选出的4菌株按筛选地点及日期分别编号A-0423-21（球菌）、A-0504-9（杆菌）、A-0508-57（球菌）、A-0603-11（杆菌）和B-0510-68（球菌）。对以上5株菌进一步的优化培养发现，A-0603-11菌为产PHA最好菌株，经苏丹黑染色镜检发现有2～3个PHA颗粒，黑色部分的体积占菌体50%以上，为最好菌株，并对之加以分析鉴定。

NCBI Blast 数据库比对结果如图1所示。PCR扩增区域1 497 bp 与文献报道的Delftia sp. hg-1 16S完全一致，说明该菌为Delftia sp，属于Comamonadaceae丛毛单胞菌科，暂定该菌名称为Delftia sp.A11。但Delftia sp.A11不一定就是Delftia sp. hg-1 菌株，因为只PCR扩增了16S rDNA的一部分序列。

2.3 生理生化特性

生理生化试验表明，A-0603-11菌即Delftia sp.，为革兰氏阴性杆状，单鞭毛运动，好氧，氧化酶阳性，接触酶阳性，不发酵D-葡萄糖和其他糖类。

3 结论与讨论

本试验从15个污泥样品中，筛选分离出产碱菌共129株，又从产碱菌株中分离筛选出5株PHA产生菌。对这5株菌进一步的优化培养发现，A-0603-11为产PHA最好菌株，经苏丹黑染色镜检发现有2～3个PHA颗粒，黑色部分的体积占菌体50%以上。生理生化试验表明，该菌为革兰氏阴性杆状，单鞭毛运动，好氧，氧化酶阳性，接触酶阳性，不发酵D-葡萄糖和其它糖类。经分子生物学鉴定该菌为Delftia sp.，属于Comamonadaceae丛毛单胞菌科。

基于PHA 的研究、生产和应用开发是一个高科技、绿色、可持续的产业链， 随着石油价格的不断上涨，国家对能源安全和生态环境文明建设的重视， 以可再生资源为原料的PHA 材料逐渐为政府和企业界日渐重视。国内对PHA 微生物生产的研究也正逐步降低材料成本， 同时一些高附加值的应用开发也取得了初步的成果， 一些大型发酵企业也加入到PHA 的研发和生产中， 推动了产、学、研的有机结合。相信在国家政策和资金支持、在科学界和产业界的不断努力下， 以PHA为基础的相关生产和应用研究将会得到更快的发展。

面对当前的农业面源污染，如农用地膜的污染、化肥过量以及不合理应用造成的污染等，国家提出了建设农业生态文明的战略要求，健康可持续的农业发展模式是实现这一战略要求的基本条件之一，应用环境友好型的新型农用材料是实现可持续农业发展模式的必备条件之一。PHA材料在农业上的应用基础研究应该得到重视，如可加工制造可降解的生物保水剂以逐渐代替已造成面源污染的农用地膜，生产用作肥料的缓释剂载体等。

基于以上考虑，在已筛选出PHA高产生菌Delftia sp.A11的基础上，今后应进一步研究该菌合成的PHA组分、含量以及相关基因组成，为建立自有菌种资源库，构建工程菌株，为实现PHA材料在农业生产中的应用和推广奠定基础。

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