高效液相色谱法测定不同厂家克拉霉素颗粒的溶出度

隋思博，宫丽婷

（吉林省药品检验所，吉林 长春 130033）

高效液相色谱法测定不同厂家克拉霉素颗粒的溶出度

隋思博，宫丽婷

（吉林省药品检验所，吉林 长春 130033）

目的采用HPLC法测定不同厂家克拉霉素颗粒的溶出度。方法采用Hibar Purospher STAR C18（250×4．6 mm，5 μm）色谱柱，柱温：45℃，以磷酸盐缓冲液-乙腈（600：400）为流动相，检测波长为210 nm；流速为1．0 ml/min。结果克拉霉素在687．5～5500 μg进样范围内有良好的相应关系，回归方程为y=60．663x+1540．5，r=0．9992。结论HPLC法具有准确度高、重复性好、快速、精密的优点，更加适合克拉霉素颗粒溶出度的测定。

高效液相法；克拉霉素颗粒；溶出度

克拉霉素属于大环内酯类抗生素，主要通过与敏感细菌核蛋白体的50S亚基结合，抑制敏感细菌蛋白合成，发挥抑菌或杀菌作用。适用于治疗幽门螺杆菌感染、呼吸系统感染、非淋菌性泌尿生殖道感染以及皮肤软组织感染等。

2015年版中国药典二部收录了克拉霉素颗粒，溶出度采用的方法是将克拉霉素与75%硫酸反应测定其吸光度，通过试验我们知道，硫酸反应操作复杂且效果不好。本文通过建立高效液相色谱法使试验操作简单，使方法更加准确、高效。

1 仪器与试药

岛津LC-2010 CHT全自动高效液相色谱仪；RC-806溶出试验仪；克拉霉素（中国药品生物制品鉴定所，130558-200902，97.9%）；醋酸钠、三乙胺、磷酸二氢钾、冰醋酸、磷酸、乙腈、超纯水、0.45纳米微孔滤膜；克拉霉素颗粒（海南惠普120402，130802；天津红日1212261，1302011,1309241；湖北东信130101；湖北华世通潜龙130813）。

2 方法与结果

2.1 溶出度测定法

以0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH7.0）（取无水醋酸钠82 g，加水7500 mL，用冰醋酸调节pH值至7.0，加水使成10000 mL）900 mL为溶出介质，转速50转/min，30 min时取样，用溶出介质稀释制成每1mL中含55 μg的溶液。

2.2 色谱条件与系统适应性条件

流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾9.11 g，加水溶解并稀释至1000 mL，加三乙胺2 mL，用磷酸调节pH至5.5）-乙腈(600:400)，检测波长为210 nm；流速为1.0 ml/ min，柱温：45oC，Hibar Purospher STAR C18 (250×4.6 mm，5μ m)色谱柱；进样量为50 μL。克拉霉素峰的理论板数计算应高于3000，拖尾因子应小于2，克拉霉素峰与相邻前杂质峰的分离度应大于1.5，限度为80%。

2.3 配置对照品

精密称取克拉霉素对照品适量（约相当于主成分22 mg），置100 mL量瓶中，先加少量乙腈振摇使溶解，再加溶出介质稀释至刻度，精密量吸取12.5 mL置50 mL量瓶中，加溶出介质，制成对照品溶液（55 μg/mL）。

2.4 检测限与定量限检验

检测限：精密量取对照品溶液1 mL，置200 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液，精密量取20 μL注入液相色谱，此时信噪比为3:1，克拉霉素四种介质溶液（水、ph1.2缓冲液、ph5.0缓冲液、ph6.8缓冲液）进样量均为5.5 ng。

定量限：精密量取检测限溶液1 mL，置200 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液，精密量取20 μL注入液相色谱，此时信噪比为10：1，硝酸异山梨酯四种介质溶液进样量均为13.75ng。

2.5 耐用性

柱温45℃。①采用Hibar Purospher STAR C18（250×4.6 mm，5 μm）色谱柱测定。②采用Kromasil Eternity （250×4.6 mm，5 μm） PN:EH50704色谱柱测定。③采用Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5 μm）PN:990967-902色谱柱测定。采用上述三根不同厂家色谱柱柱进行试验，结果均能很好的分离，可以用于克拉霉素颗粒的测定。

2.6 线性关系与回归方程

精密量取对照品溶液2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL、15 mL、20 mL，分别置不同的20 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，制成浓度分别为6.875 μg/mL、13.75 μg/mL、20.625 μg/mL、27.5 μg/mL、41.25 μg/mL、55 μg/mL的对照品溶液，各精密吸取100 μL注入液相色谱仪，横坐标为对照品进样量（μg），纵坐标为峰面积，计算回归方程并且绘制标准曲线，可以得出，克拉霉素在687.5～5500 μg进样范围内有良好的相应关系，回归方程为y=60.663x+1540.5，r=0.9992。见表1。

2.7 精密度实验

取对照品溶液，重复6次进样，50 µl/次，结果符合要求。见表2。

2.8 回收率实验

精密称取克拉霉素对照品22.12 mg，置100 mL量瓶中，加醋酸盐缓冲液（pH7.0）稀释至刻度，加乙腈10 mL，振摇使溶解，精密量取12.5 mL，置50 mL量瓶中，用醋酸盐缓冲液（pH7.0）稀释，制成回收对照品溶液（55μg/mL）；另精密称取克拉霉素原料（浙江国邦药业有限公司）约11 mg、17.6 mg、22 mg各3份（50%、80%、100%），分别置100 mL量瓶中，加入处方量的辅料，加乙腈10 mL，振摇使溶解，用醋酸盐缓冲液（pH7.0）稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取12.5ml，置50 mL量瓶中，用醋酸盐缓冲液（pH7.0）稀释，制成供试品溶液；吸取回收对照品溶液和供试品溶液各50 μL，注入液相色谱仪，计算回收率。见表3。

表1 标准曲线数据

表2 精密度实验结果

表3 克拉霉素在醋酸盐缓冲液（pH7.0）的回收率结果(n=9)

2.9 溶出度曲线对比

取克拉霉素颗粒（生产厂家为湖北华世通潜龙，批号：130813）照中国药典2015年版溶出度第二法测定，以0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH7.0）900 mL为溶出介质，转速为50转/min，分别在以下时间取样：5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min，滤过。分别量取50μl注入高效液相色谱仪，取克拉霉素对照品溶液（55μg/ml）50μl注入高效液相色谱仪，用峰面积以外标法计算，绘制溶出曲线。同时，按照中国药典2015年版二部克拉霉素颗粒溶出度方法（硫酸显色UV比色法检测），绘制溶出曲线（见图2）。

图2 克拉霉素颗粒硫酸显色UV法与PLC测定结果比较

比较两种方法的溶出曲线，可明显的看出HPLC法与UV法存在一定差异。HPLC溶出曲线更加平滑，溶出值更大，更能反应真实的溶出量。

2.10 不同厂家克拉霉素颗粒溶出度测定

取不同厂家的供试品，照中国药典溶出度第二法检验，30min时取样，滤过，用溶出介质稀释制成55μg/ml的供试液，注入高效液相色谱仪，计算溶出度。同时与UV比色法的数据进行对比，结果。可以看出，HPLC法，结果准确、差异更小。见表4。

3 结论与讨论

通过实验与查阅文献[3-5]，总结出克拉霉素颗粒溶出度方法为：取本品，照溶出度测定法（附录X C第二法），以0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH7.0）（取无水醋酸钠82 g，加水7500 mL，用冰醋酸调节pH值至7.0，加水使成10000mL）900 mL为溶出介质，转速为50转/min，依法操作，30 min时，取续滤液适量，用溶出介质定量稀释制成55 μg/mL的溶液，作为供试品溶液；精密称取克拉霉素对照品适量，加少量乙腈溶解，用溶出介质定量稀释制成55 μg/mL的溶液，作为对照品溶液；照含量测定项下的方法试验，精密量取上述两种溶液各50 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算溶出量，限度为80%，仅供参考。

通过溶出度曲线的比较、溶出度测定，都可以明确的看出HPLC法优于UC法。克拉霉素与硫酸反应容易受到外界影响，不同的厂家，不同的批号，浓度上的差异，硫酸放置时间，环境的温度，反应是否彻底等等，都会对结果产生影响，无法保证试验的重现性。而HPLC法可以大大节约试验时间，降低操作过程中人为因素的影响，排除硫酸显色中过程不稳定因素的影响，避免了由于硫酸反应不完全带来的干扰， 同时，HPLC法具有准确度高，重复性好的优点。能够使克拉霉素颗粒溶出试验更加准确、科学。

表4 克拉霉素颗粒溶出度测定结果

[1] 吴美芳.高效液相色谱法测定克拉霉素片的溶出度[J].中国药师,2008,12:1525-1526.

[2] 王 巍,曹盛宗,王 勇.高效液相色谱法测定克拉霉素微丸的溶出度[J].海峡药学, 2010,03:48-50.

[3] 汲 静,赵甜爽. 高效液相色谱法测定克拉霉素片的溶出度[J].黑龙江科技信息,2013,22:19.

本文编辑：李 豆

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ISSN．2095-8242．2017．13．2393．03