微生物检测法测定多抗菌素发酵液生物效价

胡永红　杨洋　张棋　王济奎　杨文革

摘要：以多抗菌素生产菌（Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382）为试验菌株，水稻纹枯菌为指示菌株，用管碟法测量不同浓度多抗菌素标准品抑菌圈大小，多抗菌素标准品在质量浓度为200～2 400μg/mL范围内线性拟合度良好，其线性回归方程为：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。确定牛津杯最适装液量为200μL，精密度相对标准偏差RSD为1.51%，稳定性良好。该法能快速检测多抗菌素效价且灵敏度高，操作简便，回收率高。

关键词：多抗菌素；管碟法；精密度；稳定性

中图分类号：S188 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0306—02

多抗菌素（polyoxins）也被称为多抗霉素、多效霉素、多氧霉素，能够抑制真菌细胞壁几丁质的合成，已经被广泛应用于治疗番茄灰霉病、水稻纹枯病和梨黑斑病等植物真菌病害，是一种抗真菌核苷类抗生素和能够有效防治植物真菌病害的生物农药。多抗菌素不是一种纯净物，由于其碳链上R1、R2、R3 3个位点上官能团的变化，使多抗菌素的组分有多抗菌素A至多抗菌素N 14种之多。由于其成分的复杂性，导致了高效液相色谱法（HPLC）检测需要很复杂的预处理，同时，考虑到HPLC检测的成本、周期等因素，因此，用多抗菌素微生物检测法探索具有重要意义。本研究以多抗菌素生产菌（Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382）为试验菌株，采用管碟法测量多抗菌素效价，同时进行了精确度、稳定性试验，显示出了良好的效果。

1材料与方法

1.1试验菌种

多抗菌素产生菌Streptomyces aureochromogenes NJYH-WG66382，由课题组保藏。水稻纹枯菌：由课题组保藏。多抗菌素标准品是由江苏丰源生物有限公司提供。

1.4试验万法

1.4.1标准溶液配制 精确称取60 mg多抗菌素标准品置于容量瓶中，用蒸馏水溶解，振荡，定容至25 mL，得到浓度为2 400μg/mL的标准溶液，置于4℃冰箱备用。

1.4.2发酵液前处理 取发酵培养基，倒入50 mL离心管，10 000 r/min，4℃离心15 min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，收集，置于4℃冰箱备用。

1.4.3管碟法检测多抗菌素含量 取直径90 mm、高16 mm的平板，向平板中倒入15 mL加热融化的PDA培养基，使其在碟内均匀分布，放置在水平工作台上，凝固。取直径约为2 mm的水稻纹枯菌苔，置于平板1/3处，在平板相对位置放置牛津杯[内径（6.0±0.1）mm，外径（8.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm]，静置15 min，使其在培养基上沉降稳定后，使用移液枪向牛津杯中添加200μL发酵液。放置在28℃培养箱中培养24 h后，在平板底部垫上1张白纸，用游标卡尺测量抑菌圈直径，并记录。

1.4.4线性试验 将标准品分别稀释至不同浓度，分别为200、800、1 000、1 600、2 000、2 400μg/mL，使用管碟法（牛津杯法）测定不同浓度多抗菌素标准品的抑菌圈大小（表1），以抑菌圈直径（mm）为横坐标，多抗菌素浓度（μg/mL）为纵坐标绘制标准曲线（图1）。

1.4.5稳定性试验 取“1.4.4”节中发酵液6份，分别在0、6、12、18、24 h按“1.4.3”节方法检测多抗菌素含量。

1.4.6精密度试验 准确吸取多抗菌素标准品储备液，按“1.4.3”节方法进行检测，做6组平行试验。

1.4.7回收率试验 取已知多抗菌素含量的发酵液5份，分别加入同等体积、相同浓度的多抗菌素标准品溶液，按“1.4.4”节方法进行测定，计算回收率。

2结果与讨论

2.1标准曲线

根据抑菌圈大小绘制标准曲线，从图1可以看出，多抗菌素浓度在200～2 400μg/mL范围内线性拟合度良好，其回归方程为：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。

2.2牛津杯最佳装液量

分别通过添加100、150、200、250μL的多抗菌素标准溶液，来观察抑菌圈大小。当牛津杯装液量为250μL时，由于液体表面张力，在牛津杯上方会形成一个曲面弧度，发酵液会因为接触培养皿上盖而造成损失，影响检测结果。随着装液量的减少，平板上抑菌圈逐渐变小，因此选择200μL的装液量最为合适。

2.3稳定性试验

对发酵液在24 h内稳定性进行抑菌圈觀察分析。结果（图2）表明，发酵液在24 h内多抗菌素含量基本稳定，未发生显著变化。

2.4精密度试验

选择2400μg/mL的标准品溶液进行6次平行试验，分别测量抑菌圈大小，RSD为1.51%（n=6），表明该方法精密度较好（表3）。

2.5回收率试验

通过回收率试验，测量混合液形成的抑菌圈直径，结果见表4，试样回收率分别为99.3%～101.4%，其RSD值为1.87%～2.15%，其平均回收率为100.1%，回收率效果较好。

3结论

本研究建立了管碟法测量发酵液中多抗菌素含量的方法，使用水稻纹枯菌为指示菌株。多抗菌素标准品在质量浓度为200～2 400μg/mL范围内线性拟合度良好，其线性回归方程为：y=138.23x-2 058.46，r²=0.998 4。并验证了该法的稳定性和精密度，证明回收率较高。由于微生物检测法操作简便、成本低，相对于HPLC法对于仪器设备的要求低，因此，可采用微生物检测法代替HPLC法检测发酵液中多抗菌素的含量。