突变菌PS 2对石油烃污染土壤的修复研究

张子间，卢 杰，安久涛，孟庆梅，马艳飞

(山东理工大学 资源与环境工程学院，山东 淄博 255049)

突变菌PS 2对石油烃污染土壤的修复研究

张子间，卢 杰，安久涛，孟庆梅，马艳飞

(山东理工大学 资源与环境工程学院，山东 淄博 255049)

在实验室条件下模拟了石油烃污染土壤的生物修复试验，发现突变菌PS 2对土壤中的石油烃污染物降解速度明显高于其野生菌株SY-02. 对土壤中的土著微生物、含水量、接种量、分散剂等影响微生物降解速度的因素进行研究，结果表明：土壤中的土著微生物对石油烃的降解有明显的促进作用；当土壤含水量在20%～25%之间时，石油烃的降解效果最好，其最高降解率达到93%；当接种量在150～250 mL之间时，突变菌PS 2对石油烃的降解效果最好，其中接种量为200 mL时，其降解率最高为93.4%. 土壤分散剂可以明显地提高石油烃的生物降解速度，其中稻壳作为分散剂降解效果最好，其最终降解效率达到93.1%. 该研究结果可以为石油烃污染环境的高效生物修复提供参考依据和理论基础.

石油烃；PS 2菌；土壤修复

在石油开采过程中，石油经常会洒落到地面，使土壤和地下水受到污染[1-2].石油中的烷烃、环烷烃和多环芳烃类物质通过食物链进入人体，严重危害人体健康[3]. 目前治理土壤石油污染的方法有物理法、化学法和生物法，其中生物法由于成本较低、方法简单、无二次污染等特点，成为土壤石油污染修复的重要发展方向[4-5]. 传统的生物法治理土壤石油污染都是利用分离到的野生菌对石油烃污染物的同化降解作用，使其完全矿化，转变为无污染的无机物质(CO2和H2O).提高微生物降解效率的方法则主要通过投加不同种类的石油烃降解菌群、改善土壤条件(如pH值、湿度、供氧及添加微量元素等)来实现[6-12]. 而将紫外诱变技术、离子注入技术、基因工程技术、激光诱变技术等现代工业微生物育种技术[13]用于高代谢能力石油烃降解菌的选育，并将选育出的具有高代谢能力的降解菌应用于石油烃污染土壤生物修复的相关研究较少. 本文在传统生物修复技术的基础上，利用激光诱变育种技术选育出的具有高代谢能力的突变菌PS 2对石油烃污染土壤修复进行了研究.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

绿针假单胞菌(P.chlororaphisSY-02).

绿针假单胞菌突变株PS2：为以P.chlororaphisSY-02的菌悬液作为诱变材料，经激光诱变选育而得的高效石油烃降解菌，由本实验室保藏.

1.2 主要仪器

BS-TE恒温振荡培养箱；GC9160气相色谱仪(日本岛津)；TDL-60B型低速台式离心机；FA-1004型电子天平.

1.3 培养基与试剂

LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、无机盐培养基[14]. 柴油(本实验中以柴油代表石油烃)由齐鲁石化炼油厂提供(约含65%芳香烃和30%脂肪烃)；其它试剂均为AR级国产试剂.

1.4 实验土样

试验用土采集自张店区普通农田. 土样经碎散、除杂、过筛(1mm)、混均，密封闭光储存在储存容器内，备用. 对土样基本性质做了测定，测定结果见表1.

表1 土样的基本理化性质

1.5 实验方法

1.5.1 土样的制备

称取30.27g柴油，加入到15kg的土样中，混匀，使土壤中柴油含量为2g/kg(即石油烃浓度0.2%)，密封闭光储存在储存容器内(图1)，备用.

图1 实验土样图片

1.5.2SY-02及其突变株PS2对石油烃污染土壤的降解试验

供试土样为沙质土壤，置于直径20cm的玻璃培养皿中，其基本理化性质见表1.将SY-02及其突变株PS2分别接种于牛肉膏蛋白胨培养液中培养24h，离心收集菌体后用无菌水冲洗菌体并分别制成5%的菌悬液.然后根据实验要求取200mLSY-02或其突变株PS2的菌悬液加入到1kg的模拟石油污染土壤中，同时向土样中加入50mL的无机盐培养液，搅拌均匀. 试验分2组进行，Ⅰ：(1)灭菌土样+石油烃；(2)灭菌土样+石油烃+5%P.chlororaphisSY-02菌悬液；(3)灭菌土样+石油烃+5%PS2菌悬液.Ⅱ：(1)非灭菌土样十石油烃;(2)非灭菌土样十石油烃+5%P.chlororaphisSY-02菌悬液；(3)非灭菌土样十石油烃+5%PS2菌悬液，每个处理重复3次，土样灭菌采用湿热法，重复灭菌两次.将实验土样置于室温20℃条件下避光培养30d，进行石油烃污染土壤的生物修复试验，并分别于处理后的0、3、5、10、15、20、25、30d取土壤样品，测定土样中残余石油烃的含量.实验过程中定期翻动土壤改善土壤的通气状况，定时向实验土样补加无菌水，使各处理中土壤湿度保持相同(保持土壤含水量约25%).

1.5.3 土壤水分含量对突变菌PS2降解石油烃的影响

供试土样为沙质土壤，土壤含水率分别设定为10%、15%、20%、25%、30%和35%，其余处理同1.5.2节，处理25d后取样测定土壤中残余石油烃的含量.在试验中适当补充丧失的水分，使土壤中水分含量始终保持在设定水平.

1.5.4 接种量对突变菌PS2降解石油烃的影响

供试土样为沙质土壤，分别取100mL、150mL、200mL、250mL和300mL突变菌PS2的菌悬液加入到1kg的模拟石油污染土壤中，其余处理同1.5.2节，处理25d后取样测定土壤中残余石油烃的浓度.实验过程中定时向实验土样补加无菌水，使各处理中土壤湿度保持相同(保持土壤含水量约25%).

1.5.5 分散剂对突变菌PS2降解石油烃的影响

分别将60g已灭菌的锯末、秸秆末、麸皮和稻壳加入到1kg模拟石油污染土壤中，然后根据实验要求加入200mL突变菌PS2的菌悬液，同时向土样中加入50mL的无机盐培养液，搅拌均匀.处理20d后取样测定土壤中残余石油烃的含量.实验过程中定时向实验土样补加无菌水，使各处理中土壤湿度保持相同(保持土壤含水量约25%).

1.5.6 石油烃的提取与测定

称取土样5.0g,置于50mL碘量瓶中静置过夜,分3次加入正己烷溶剂为20mL、10mL、10mL，每次混合均匀中速振荡30min，置于高速离心机离心15min.离心后的上清液转移至50mL容量瓶，沉淀部分再重复振荡离心步骤.合并3次振荡离心获得的上清液，定容后测定石油烃的含量并计算降解率。石油烃(柴油)浓度测定采用气相色谱法(GC)[15].

2 结果与讨论

2.1 SY-02及其突变株PS 2对石油烃污染土壤的降解试验

在石油烃污染土壤生物修复实验中，SY-02及其突变株PS2对石油烃的降解效果见图2.

由图2(a)可以看出，与对照组(灭菌土样+石油烃)相比，P.chlororaphisSY-02及其突变菌PS2的石油烃最终降解率分别达到了70%和90%以上，取得了较好的降解效果.而由图2(b)可以看出在30d的修复期内，与对照组(非灭菌土样+石油烃)相比接种P.chlororaphisSY-02和PS2菌液的两个处理土壤中的石油烃降解率分别达到了72.5%和98%. 实验结果还表明：在相同的修复时间内采用非灭菌土样处理Ⅱ的石油烃降解效率明显高于采用灭菌土样处理Ⅰ.这主要是因为石油烃是由多种化学组分组成，因此须由各种功能不同的微生物共同作用才可能彻底降解其中的石油烃污染物. 在非灭菌土样中P.chlororaphisSY-02及其突变菌PS2分别与土壤中的微生物组成了石油烃降解菌群，从而提高了石油烃污染物的微生物降解效率.

(a) 灭菌土样

(b) 非灭菌土样

2.2 土壤水分含量对突变菌PS 2降解石油烃的影响

水分的含量是影响石油烃微生物降解转化的一个重要因素；同时在土壤环境中，水分还参与所有物质的转运、吸收、消化以及生物酶的反应，没有水分微生物就无法生存，因此土壤中水分含量的高低直接影响到微生物降解石油烃的效率.不同含水率对突变菌PS2石油烃降解效率的影响见图3.

图3 不同含水率对石油烃降解的影响

由图3可知，当水分含量在25%时，突变菌PS2生长最好，石油烃的降解效率最高，可达到93%. 实验结果表明突变菌PS2的代谢需要一定的空隙度和较高的空气相对湿度，适当的含水率不仅有利于土壤中气体的交换，同时还使菌体的表面保持湿润，有利于土壤中微生物的生长和对石油烃的降解.因此本修复试验中设定土壤含水率25%较为合适.

2.3 接种量对突变菌PS 2降解石油烃的影响

接种量对突变菌PS2降解石油烃的影响结果见图4.

图4 不同接种量对石油烃降解的影响

由图4可以看出，当接种量在150～250mL之间时，突变菌PS2对石油烃的降解效果最好，其中接种量为200mL时，其降解率最高为93.4%. 当接种量大于200mL时，随着接种量的增加石油烃的降解率不断降低，这可能是由于降解菌的密度抑制作用造成的.因为随着接种量的增加，突变菌PS2大量生长，菌体密度大大增加，导致单位体积内生物量过多，造成土壤中碳源和微量元素短缺，从而不利于单个菌株的生长及微生物对石油烃的吸收降解，而且过多的接种量还会造成污染土壤修复成本的增加.因此本试验中选择200mL为较合适接种量.

2.4 不同分散剂对突变菌PS 2降解石油烃的影响

各种分散剂不仅能膨松土壤，使土壤颗粒间保持一定的孔隙度，提供氧气、二氧化碳迁移和交换的有利条件，还可以保持土壤温度，调节土壤水分的含量，从而有利于微生物对石油烃的降解. 由图5可以看出，添加各种分散剂可以明显地提高突变菌PS2对石油烃的降解速率，其中稻壳和锯末作为分散剂对石油烃降解效率的提高影响较大，其最终石油烃降解率分别比对照组提高了23%和20%，麸皮和秸秆末次之.这是由于麸皮和秸秆末粉碎度较小，减少了氧气供给，因而不利于突变菌PS2的生长和对石油烃的降解，使得最终降解率较低.

图5 不同分散剂对石油烃降解的影响

3 结论

(1)通过灭菌土壤和未灭菌土壤对照试验发现，在灭菌土壤和未灭菌土壤中，突变菌PS2的石油烃降解率都明显高于野生菌P.chlororaphisSY-02.

(2)土壤中的土著微生物对石油烃的降解起促进作用，这是因为土著微生物在与污染物接触过程中，通过诱导也可以获得降解能力.

(3)微生物对石油烃的降解易受土壤环境的影响，土壤含水量、菌液接种量、土壤分散剂等都能在很大程度上改变微生物的降解速度. 当水分含量在20%～25%之间时，突变菌PS2对石油烃的降解效果最好，其最高降解率达到93%；当接种量在150～250mL之间时，突变菌PS2对石油烃的降解效果最好，其中接种量为200mL时，其降解率最高为93.4%. 土壤分散剂可以显著地提高石油烃的生物降解速度，其中稻壳作为分散剂降解效果最好，其最终降解效率达到93.1%.

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(编辑：姚佳良)

Remediation of petroleum hydrocarbons contaminated soil by degrading mutant strain PS 2

ZHANG Zi-jian, LU Jie, AN Jiu-tao, MENG Qing-mei, MA Yan-fei

(School of Resources and Environmental Engineering, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China)

Through simulating biodegradation experiment in soil contaminated by petroleum hydrocarbon, the researchers discovered that the biodegradation rate of mutant PS 2 was much higher than its wild strain SY-02. The influence of indigenous microorganisms, water content, inoculation amount and dispersant on bioremediation was also studied. The optimal water content and inoculation amount for bioremediation were 20% to 25% and 200 mL in simulating soil. The increase of dispersant can obviously enhance the biodegradation rate,and the simulation experiments showed that the petroleum hydrocarbon biodegradation rate of four kind of dispersant was higher than the soil (control) in beaker. When rice husk was treated as dispersant, its degradation rate was highest,and the final degeneration rate was 93.1%. The results can provide a reference and theoretical basis for the application of bioremediation in petroleum hydrocarbon-contaminated soil.

petroleum hydrocarbon; degrading strain PS 2;bioremediation of soil

2016-09-22

山东省自然科学基金项目(ZR2012DL05)

张子间，男，zhangzijian1116@163.com

1672-6197(2017)04-0001-04

X172

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