两种绘制枯草芽孢杆菌和大肠杆菌生长曲线方法的比较

何岚　王柳懿　朱琪　乔家运　王文杰

摘 要：利用分光光度法和活菌计数法对大肠杆菌O78和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.504的生长曲线进行测定，并根据两种方法在细菌对数生长期的线性关系，筛选相关系数最大的吸光度。结果表明：大肠杆菌O78培养中0～2 h为迟缓期，2～12 h为对数生长期，12～20 h为稳定期，20 h以后进入衰亡期。枯草芽孢杆菌CGM培养中0～2 h为迟缓期，2～12 h为对数生长期，12～18 h为稳定期，18 h以后进入衰亡期。在两种细菌的对数生长期，分光光度计测出不同吸光度下的OD值和活菌计数法测得的细菌数都表现出一定的线性关系，且在吸光度为630 nm时，O78和CGM的OD值和活菌数相关系数最大（R2O78 = 0.991 2，R2CGM = 0.990 4），相关程度最高。

关键词：枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；生长曲线；分光光度法；活菌计数法

中图分类号：Q936 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.004

Abstract： Escherichia coli O78 and Bacillus subtilis CGMCC 1.504 growth curves were determined by spectrophotometric method and viable count method，using the linear relationship of two methods in logarithmic growth period of bacteria to select the absorbance maximum of the correlation coefficient. The results showed that 0～2 h was in the lag phase； 2～12 h was in logarithmic growth phase in the cultivation of Escherichia coli O78； 12～20 h was stable， after 20 h O78 entered into decline phase. In the cultivation of Bacillus subtilis CGM， 0～2 h was in the lag phase； 2～12 h was in logarithmic growth phase； 12～18 h was stable， after 18 h CGM entered into decline phase. In logarithmic growth phase of two germs， the number of bacteria was measured by OD value in different absorbance and the number of live bacteria measured by viable counting method showed a linear relationship. Besides， in absorbance of 630 nm， the OD value of O78 and CGM were related to the highest degree with live bacteria， and the correlation coefficient maintained maximum （R2O78 = 0.991 2， R2CGM = 0.990 4）.

Key words： Bacillus subtilis； Escherichia coli； growth curve； spectrophotometry； viable counting method

禽致病性大腸杆菌（Escherichia coli）O78在禽类肠道中广泛存在，易引起鸡及其它禽类的肠道炎症及肠外疾病，如心包炎、气囊炎、肝周炎等，甚至引起败血症而导致急性死亡[1-2]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC1.504是饲料中常添加的益生菌，在动物体内可产生各类酶，如α-淀粉酶、蛋白酶、甘露聚糖酶等[2]，利用枯草芽孢杆菌制备发酵饲料，可将饲料中的蛋白质水解成氨基酸、小肽和多肽类等物质。枯草芽孢杆菌中蛋白酶、淀粉酶的活性很高，可以促进动物机体对营养物质的吸收利用，从而促进生长发育，提高饲料利用率。枯草芽孢杆菌的芽孢体易保存，能耐受极酸或高温环境，可在适宜的条件下将粗纤维、非蛋白氮和寡糖等不易消化吸收的物质转化为优质的菌体蛋白，因此，在生产实践中常用作饲料发酵菌种[3-5]。

本试验利用分光光度法和活菌计数法分别测定大肠杆菌O78和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.504的生长性能，得到在不同吸光度下培养液的OD值和活细菌数，绘制二者的生长曲线，并对根据两种测定方法所绘制的生长曲线进行比较分析。此外，利用两种计数方法绘制出线性回归方程，并根据相关系数确定最佳吸光度，从而可以更深入地了解两种细菌的生长繁殖规律和生理特性，这对根据不同需要有效地利用和控制大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

菌种：大肠杆菌O78和枯草芽孢杆菌CGMCC1.504（以下简称CGM）由天津市畜牧兽医研究所微生物实验室保藏。

LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL（加固体琼脂粉20 g），调pH值7.0，121 ℃下高压灭菌15 min，备用。

麦康凯琼脂培养基：取麦康凯52 g，加热溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃下高压灭菌15 min，备用。

肉汤培养基：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化钠 5 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃下高压灭菌15 min，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 O78和CGM 种子液的培养 将保存于斜面的大肠杆菌O78接一菌环到肉汤培养基中，37 ℃，150 r·min-1，培养16～18 h，置于冰箱4 ℃保存，备用。

将保存于斜面的枯草芽孢杆菌CGM接一菌环到液体LB培养基中，37 ℃，150 r·min-1，培养16 ～18 h，置于冰箱4 ℃保存，备用。

1.2.2 O78和CGM不同生长时间培养液的收集 试验分为A、B两组，每组按照培养时间的不同分别取14个时间点。具体分组方法如下：取30个150 mL已灭菌的锥形瓶，其中A组15瓶装入20 mL液体LB培养基，B组15瓶装入20 mL肉汤培养基，从两组中各取一瓶标注为KA和KB，作为空白对照。将A组14个锥形瓶装入CGM培养液0.32 mL（接种量1.6%）[6]，B组14个锥形瓶装入O78培养液0.2 mL（接种量1%），震荡摇匀后，分别标记为0，1，2，3，4，6，8，10，12，14，16， 18，20， 24。将标有KA、KB和0的锥形瓶取出，立即放入4 ℃冰箱，保存备用。将其余已接入培养液的26个锥形瓶于37 ℃，150 r·min-1震荡培养，相应时间后取出锥形瓶，放入4 ℃冰箱，保存备用。

1.2.3 O78和CGM不同生长时间培养液OD值的测定 以无菌的液体培养基KA、KB作空白对照，在600 nm波长下，用光程1 cm的比色皿通过比浊法测定O78和CGM不同生长时间培养液的OD值。分别于培养的0，1，2，3，4， 6，8，10，12， 14，16，18，20，24 h时取出3 mL菌液，分別测定450，490，570，600，630，650 nm吸光度下的OD值，每个时间点重复测定3次取其平均值。

1.2.4 活菌总数计数 采用平板计数法，将菌液逐级稀释，分别稀释至10-5，10-6，10-7，10-8，10-9混匀，取400 L涂平板，37 ℃，培养24～36 h，选取菌落数30～300为有效计数平皿，进行计数。依照下式计算出O78和CGM各生长时间的细胞密度（cfu·mL-1）：

CFU=（C÷V）×M

式中：C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂平板时所用稀释液的体积，M代表稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 O78和CGM不同吸光度下培养液的OD值和活菌数

O78和CGM不同吸光度下培养液的OD值和活菌数见表1、表2。

2.2 O78不同吸光度培养液的OD值培养时间的关系

以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，作O78的生长曲线，结果如图1。

2.3 CGM不同吸光度培养液的OD值培养时间的关系

以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，作CGM的生长曲线，结果如图2。

2.4 O78和CGM的活菌数和时间的关系

以培养时间为横坐标，活菌数为纵坐标，作O78和CGM的生长曲线，结果如图3。

2.5 不同吸光度O78和CGM在对数生长期的OD值与活菌数的函数关系

以OD值为横坐标，活菌数的对数为纵坐标，绘出不同吸光度下两者间的回归曲线。 O78不同吸光度下的回归方程见图4，CGM不同吸光度下的回归方程见图5。结果表明，在吸光度为630 nm时，O78和CGM的OD值和活菌数均表现出较强的相关性（R2O78 = 0.991 2，R2CGM =0.990 4），相关系数最大。

3 结论与讨论

生长曲线是描述生物生长繁殖变化的曲线[7]。以细菌的培养时间为横坐标、以其数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。细菌生长曲线的绘制方法有很多，有血细胞计数法、活菌计数法、称重法、分光光度法等。其中应用最广泛的主要有分光光度法和活菌计数法两种。分光光度法是通过一定的吸光度测定菌液的OD值，测得的菌液中包含的是总菌数，该方法操作简便，耗时较短。活菌计数法得出的是菌液中的活菌数，其结果较分光光度法要准确得多，但操作复杂且耗时、耗力。因此，将两种方法结合起来，在使试验方法变得更简便的同时也能保证结果的准确性，就显得尤为关键。

在严格控制培养条件的前提下，可通过测定培养液的OD值来推算对数生长期的活菌数，代替活菌计数法。在生产实践中也可以将细菌OD值作为判断细菌是否进入对数生长期的依据[8]。利用分光光度法和活菌计数法测定细菌的生长曲线，在停滞期和对数期测定的结果基本一致[8-9]。对于某些细菌而言，这两种计数方法绘制的生长曲线有很好的相关性[10-12]。分光光度法测定的是细菌总数，而活菌计数法测定的是活菌数。因此，进入稳定期后两种方法的测定结果显著不同[13]。

生长曲线反映了细菌在不同的培养条件下所表现出的生长规律和繁殖特点。不同的细菌在相同的培养条件下生长曲线会有不同，即使是同一种细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同[14]。王升智等[15]研究表明：重组大肠杆菌DH5α的生长经历了迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期4个时期，符合细菌生长的规律；重组大肠杆菌生长至平台期时提取质粒的量最多。熊海燕等[16]采用浊度法测量发酵液浓度，确定波长为560 nm，以新鲜苹果汁、柑橘汁为原料，进行生长曲线的测定，发现菌种的生长规律基本保持同一性。李丽等[17]采用分光光度法测定产氨短杆菌不同生长时间的生长曲线图，同时利用活菌菌落计数法绘出生长曲线进行进一步验证。结果表明：产氨短杆菌在适宜生长条件下经历迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期4个时期，符合细菌生长的规律。

本试验结果表明，大肠杆菌O78培养中0～2 h为迟缓期，2～12 h为对数生长期，12～20 h为稳定期，20 h以后进入衰亡期。枯草芽孢杆菌CGM培养中0～2 h为迟缓期，2～12 h为对数生长期，12～18 h为稳定期，18 h以后进入衰亡期。O78 和CGM培养液在不同吸光度下的OD值和活菌数在对数生长期均表现出很好的相关性，且在吸光度为630 nm时，O78和CGM的OD值和活菌数相关系数最大（R2O78 = 0.991 2，R2CGM =0.990 4 ），相关程度最高，在此处依据OD值推测出的活菌数也更加接近实际活菌数。

通过分光光度法和活菌计数法在对数生长期求得的回归方程，可以更加准确地推测出细菌在对数生长期的准确活菌数，避免了繁重的试验步骤。

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