小麦WRKY转录因子VIGS基因沉默载体构建及验证

蒋鲁亚　王君雅　孙依帆　刘晓颖　王振英

摘 要：WRKY转录因子家族广泛存在于各种植物中，有助于提高植物抗逆性。本研究用病毒介导的基因沉默方法沉默Brock中克隆到的TaWRKY基因，发现白粉菌成功侵染小麦叶片的比例上升，畸形胞比例下降。研究表明，TaWRKY基因在小麦抵抗白粉菌侵染过程中发挥着重要作用。

关键词：小麦；白粉病；WRKY；VIGS

中图分类号：S512 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.001

Abstract：WRKY transcription factor family can help improve plant stress tolerance， which widely exist in various plants. After TaWRKY gene was silenced by VIGS method， it was found that the proportion of succeed Bgt inoculation increased， and the percentage of abnormal appressoria declined， such as papilla. The results indicated that TaWRKY gene played an important role in wheat- Bgt interaction.

Key words：wheat； powdery mildew； WRKY； VIGS

小麦白粉病是由布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici）侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高温多湿天气病害流行，会使小麦严重受害，导致减产13%～34%[1]。 因此，科学家一方面通过抗病育种，不断培育新的抗病小麦品种来抵御病害，另一方面通过深入的抗病分子机理研究，克隆抗病相关基因、弄清抗病信号通路以及基因工程等技术手段，以达到抗病分子育种的目的。

转录因子可以与真核基因启动子区中的顺式作用元件互作，激活或抑制多个下游功能基因转录，从而使植株获得综合改良效果。研究表明，WRKY转录因子家族几乎存在于所有植物中，它们共同含有一段高度保守氨基酸序列WRKYGQK[2]。WRKY广泛参与植物种子萌发与休眠、开花、代谢、激素信号转导，还参与抵御生物和非生物胁迫等反应过程。拟南芥AtWRKY33基因直接调控了植物抗毒素Camalexin 的合成[3]，并且调控大量抗病相关基因的表达[4]。大豆中GmWRKY58和GmWRKY76的过表达会造成作物提早开花，表达量的区别对花形态造成不同影响[5]。水稻中OsWRKY6基因的过表达有助于提高作物对病原菌的抗性，同时可直接调控异分支酸合成酶的表达从而增加水杨酸的浓度实现自我调节[6]。小麦（Triticum aestivum）TaWRKY93可调节作物对渗透压、高盐、干旱和低温等胁迫的耐性[7]。迄今为止，研究人员已经在大麦[8]、拟南芥[9]、大豆[10]和水稻[11]等多种植物中都鉴定到不同数量的WRKY转录因子。

病毒诱导基因沉默（VIGS-induced gene silencing， VIGS）是引起内源mRNA特异性降解、引起基因转录沉默的技术。VIGS试验周期短，操作简便，并且无需转化。近年来，在植物基因功能研究中，VIGS技术作为一种简单、快速、高效的反向遗传学技术在禾本科植物基因功能研究中发挥了重要作用[12-13]。

本研究以前期工作获得的TaWRKY基因为基础[14]，利用VIGS技术获得沉默植株，通过对基因沉默前后白粉菌侵染情况进行观察统计，最终确定TaWRKY基因在小麦抗白粉病过程中的功能。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

抗白粉病品种Brock，由Ray Johnson博士惠赠。

小麦白粉菌15号生理小种，由中国农业科学院植物保护研究所提供。

1.2 沉默TaWRKY的VIGS载体构建

在目的基因核苷酸序列的非保守区，设计上、下游特异性沉默引物TaWRKY-VIGS-F和TaWRKY-VIGS-R，以抗病小麦Brock总RNA合成的cDNA为模版，扩增富集沉默片段，将该片段与BSMVγ：连接构建重组载体BSMVγ：TaWRKY，构建过程参见Li 等[15]。

1.3 基因沉默效率检测

通过限制性内切酶酶切线性化、体外转录后，获得病毒RNA组分通过摩擦接种方法接种到小麦第2叶上，待接種H2O（对照1）、BSMV：GFP（对照2）和BSMV： TaWRKY组小麦第3叶伸展完全，采用抖拂法对各株植株第3叶均匀高密度接种新鲜白粉菌孢子，在相应时间点取叶片，利用半定量PCR方法检测这3组植株中TaWRKY基因的mRNA水平的水平变化，从而确定TaWRKY基因沉默的效率。

1.4 基因沉默后对小麦抗白粉病表型的影响

取接种48，72 h和7 d后的小麦叶片，用考马斯亮蓝染色方法染色并观察统计白粉菌孢子的生长发育情况，通过与对照白粉菌孢子萌发、畸形胞比例等的对比分析，确定目标基因在抗白粉病过程中的贡献。

2 结果与分析

2.1 VIGS沉默载体构建

根据已获得TaWRKY基因序列，在基因的非保守区设计添加了NheI识别序列的引物WRKY-V-F（AGCCGCAGCAGCAGAACG）、WRKY-V-R（CTTGAAGCTGGGGTCCCTC）。以含TaWRKY基因序列的重组质粒作为模板，扩增用于构建BSMV重组载体的目的基因片段，扩增结果如图1所示。目的片段大小约为250 bp左右，随后将回收后的目的片段进行酶切形成粘性末端，BSMV载体同样经过酶切回收，与目的片段进行连接，通过进一步筛选、验证，挑选阳性克隆送测验证。

2.2 VIGS技术沉默靶基因后TaWRKY表达水平检测

在TaWRKY基因的特异性核苷酸序列区段设计引物，扩增一个长227 bp的片段构建TaWRKY基因沉默载体BSMVγ：TaWRKY。本次沉默试验共设置4个组别，分别为H2O对照组（空白对照）、BSMV：GFP对照组（阳性对照）、BSMV：PDS对照组（沉默PDS基因）、BSMV： TaWRKY试验组（沉默目的基因TaWRKY）。为了验证本试验所建立的沉默体系成功有效，分别对各组摩擦接种后约15 d的小麦第3叶进行表型观察，结果如图2所示。除BSMV：PDS对照组叶片发生明显白化现象之外，其他组叶片均呈绿色，说明该基因沉默体系构建成功。

2.3 TaWRKY基因沉默效率验证

为了进一步证实TaWRKY基因是否被有效沉默，采用半定量PCR的方法，对沉默后各组植株中TaWRKY基因的转录水平进行了检测，结果如图3所示。从图中可以看出，摩擦接种后，TaWRKY试验组的mRNA水平明显低于H2O和GFP对照组，说明小麦内源TaWRKY基因被有效沉默了。另外，在接种重组病毒BSMV：GFP后，TaWRKY基因的表达也有轻微下调，该现象可能是由于病毒的侵染对植株造成了影响。

2.4 TaWRKY基因沉默植株抗病分析

为了进一步研究TaWRKY基因在小麦叶片与白粉菌的互作过程中所起到的调控作用，本研究使用考马斯亮蓝染色法分别对接种48，72 h和7 d后的GFP组、TaWRKY组小麦植株的第3叶进行固定、染色、制片，在显微镜下进行镜检，观察各时间点中，白粉菌萌发形态及生长状态，如图4所示。从图4中可以看出：染菌48 h后，TaWRKY组白粉菌孢子萌发状态优于对照组，孢子萌发，芽管伸长，形成附着胞；染菌72 h后，TaWRKY试验组白粉菌孢子大量萌发形成次生菌丝，而各对照组中，孢子萌发出现分瓣型畸形附着胞、纤细型畸形附着胞等；染菌7 d后，TaWRKY试验组白粉菌孢子大量生成串珠状分生孢子，而各对照组中，仅有少量孢子萌发形成次生菌丝。

在镜检观察孢子发育结构的同时，统计各个视野内白粉菌孢子萌发率、畸形率、寄主抗性等参数。统计结果如图5、图6所示。由图可以得出，接种白粉菌48 h后，白粉菌对TaWRKY基因沉默后的植株侵染成功率增加，畸形附着胞比例下降，与GFP对照组相比，TaWRKY基因沉默组植株白粉菌孢子萌发率上升，畸形附着胞（分瓣型附着胞、纤细型附着胞等）比例下降。

3 结论与讨论

自1994年，Ishiguro和Nakamura[16]首次從甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出第一个WRKY蛋白SPF1，研究人员对于植物WRKY转录因子家族开展了大量研究。越来越多的研究结果表明，WRKY 蛋白在植物生长发育，抵御生物以及非生物胁迫等多种生理生化过程中发挥重要作用[17]。前期工作中，笔者在小麦Brock中分离到一个WRKY类转录因子基因TaWRKY，并初步证实该基因参与了小麦的白粉菌胁迫应答反应，但还不能够较确切了解TaWRKY基因与小麦抗白粉病之间的关系[12]。

关于病毒介导的基因沉默技术已经广泛地应用于基因功能研究[18-21]，但该方法由于涉及到病毒感染，从而影响对正确结果的判断而备受争议。本研究为了降低这种系统误差，采取了3个对照组，即用GKP缓冲液作为摩擦接种介质为阴性对照，用绿色荧光蛋白基因构建γ载体BSMVγ：GFP、编码叶绿素关键酶基因PDS基因构建γ载体BSMVγ：PDS为两个阳性对照组。结果发现：GKP缓冲液和GFP对照组生长正常，没有病毒侵染后留下的病斑，生长正常，说明病毒对叶片生长没有明显影响；PDS组出现了叶片白化现象，说明PDS基因被有效沉默，表明基因沉默系统可用；基因沉默后再接种白粉菌孢子7 d后，白粉菌孢子充分萌发。与GFP组相比，TaWRKY基因沉默组小麦叶片表面的白粉菌附着胞畸形率明显下降，白粉菌的成功侵染率显著上升。因此，推测TaWRKY基因可能在小麦抗白粉菌反应中发挥着重要作用。

参考文献：

[1]GRIFFEY C A， DAS M K， STROMBERG E L. Effectiveness of adult-plant resistance in reducing grain yield loss to powdery mildew in winter wheat.[J]. Plant disease， 1993， 77（6）：618.

[2]RUSHTON P J，MACDONALD H，HUTTLY A K，et al. Members of a new family of DNA -binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters of alpha-Amy2 genes [J]. Plant molecular biology，1995，29： 691-702.

[3]MAO G H，MENG X Z，LIU Y D，et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis[J]. Plant cell， 2011，23（ 4） ： 1639-1653.

[4]BIRKENBIHL R P，DIEZEL C，SOMSSICH I E. Arabidopsis WRKY33 is a key transcriptional regulator of hormonal and metabolic responses toward Botrytis cinerea infection[J]. Plant physiol， 2012，159（1）： 266-285.

[5]YAN Y， CHI Y， WANG Z， et al. Functional analysis of structurally related soybean GmWRKY58 and GmWRKY76 in plant growth and development[J]. Journal of experimental botany， 2016， 67（15）：4727-4742.

[6]CHOI C， HWANG S H， FANG I R， et al. Molecular characterization of Oryza sativa WRKY6，which binds to Wbox-like element 1 of the Oryza sativa pathogenesis-related （ PR） 10a promoter and confers reduced susceptibility to pathogens[J]. New phytologist， 2015，208（3）：846-859.

[7]QIN Y， TIAN Y， LIU X. A wheat salinity-induced WRKY transcription factor TaWRKY93 confers multiple abiotic stress tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Biochemical and biophysical research communications， 2015， 464（2）：428-433.

[8]MANGELSEN E，KILIAN J，BERENDZEN K W，et al. Phylogenetic and comparative gene expression analysis of barley （Hordeum vulgare） WRKY transcription factor family reveals putatively retained functions between monocots and dicots [J]. BMC genomics，2008，9（ 1） ： 194.

[9]GLCKNER G，EICHINGER L，SZAFRANSKI K，et al. Sequence and analysis of chromosome 2 of Dictyostelium discoideum [J]. Nature，2002，418（ 6893） ： 79-85.

[10]SCHMUTZ J，CANNON S B，SCHLUETER J，et al. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean [J]. Nature，2010，463 （ 7278） ： 178-183.

[11]YU S， CHONG-RUI A I， JING S J， et al. Research progress on functional analysis of rice WRKY， genes[J]. 水稻科學（英文版）， 2010， 17（1）：60-72.

[12]赵丹，赵继荣，黄茜，等. 利用 BSMV-VIGS 技术快速分析小麦 TNBL1 基因的抗黄矮病功能[J]. 作物学报，2011， 37（11）： 2106-2110.

[13]李淼淼，南富波，刘伟，等.VIGS技术在禾本科植物中的应用研究进展[J]. 麦类作物学报，2016，33（2）：401-406.

[14]肖莹，刘君，刘晓颖，等. 栽培小麦 Brock 中转录因子基因 WRKY 的克隆与表达分析[J].天津农业科学，2015，21（2）：1-4.

[15]LI C， LIU X， FAN B， et al. Characterization and functional analysis of differentially expressed genes in -inoculated wheat near-isogenic lines by cDNA-AFLP and VIGS[J]. Crop science， 2014， 54（5）：2214.

[16]ISHIGURO S，NAKAMURA K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA -binding protein， SPF1， that recognizes SP8 sequences in the 5′ upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato[J]. Molecular general genetics，1994，244： 563-571.

[17]谢政文，王连军，陈锦洋，等. 植物 WRKY 转录因子及其生物学功能研究进展[J]. 中国农业科技导报，2016，18（ 3） ：46-54.

[18]BURCH S T M， SCHIFF M， LIU Y， et al. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis[J]. Plant physiology， 2006， 142（1）：21-27.

[19]HOLZBERG S， BROSIO P， GROSS C， et al. Barley stripe mosaic virus -induced gene silencing in a monocot plant[J]. Plant journal， 2002， 30（3）：315-327.

[20]李淼淼， 南富波， 刘伟，等. VIGS技术在禾本科植物中的应用研究进展[J]. 麦类作物学报， 2013， 33（2）：401-406.

[21]CAMPBELL J， HUANG L. Silencing of multiple genes in wheat using barley stripe mosaic virus[J]. Journal of biotech research， 2010， 2（1）：12-20.