芝麻物种特异性定性PCR方法的建立

王庆平　王成　兰青阔　陈锐　赵新　沈晓玲　王永　檀建新

摘 要：为鉴别食品中芝麻成分的真实性，建立了一套芝麻物种特异性定性PCR方法。根据Sesamum indicum 2S albumin-like序列，设计了3对芝麻物种特异性定性PCR引物，并对引物的特异性、最适反应浓度和最适退火温度进行了筛选和优化，建立了芝麻物种特异性定性PCR检测方法。进一步对方法的灵敏度、检出限和对芝麻加工品的适用性进行了测试。结果显示，引物sesame-1F/1R的特异性最好，最优反应条件为引物浓度0.4 μmol·L-1，退火温度60 ℃；该方法能够检测出芝麻质量分数为0.1%的样品，且对于芝麻油、芝麻酱2种性状的加工样品均有很好的扩增。该方法能够鉴别食品中芝麻成分，为食品质量安全监管提供了有力的技术支撑。

关键词：芝麻；物种特异性序列；定性PCR检验

中图分类号：S565.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.003

Abstract： To identify the authenticity of sesame ingredient in food， a set of specific quantitative PCR method for sesame species was established in this study. According to the sequence of sesamum indicum 2S albumin-like sequence， three pairs of sesame species specific qualitative PCR primers were designed. Passed the primer specificity test， PCR reaction condition and system optimize， a sesame species-specific qualitative PCR detection method was established. Then we need to make further testing on sensitivity test， detection limit test and processed product test. The results showed that the specificity of the primer sesame-1F/1R was the best， and the primer concentration was 0.4 μmol·L-1 and the annealing temperature was 60 ℃， which was the optimum reaction condition. The minimum detection limit of the specific PCR method was 0.1% （M/M）， two kinds of traits of processed samples such as sesame paste and sesame oil were well amplified. This method can identify the sesame ingredients in food which provides strong technical support for food quality and safety supervision.

Key words： sesame； species specific sequence； qualitative PCR test

芝麻具有很高的营养和保健价值，富含蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、维生素E等多种营养物质，芝麻油的油酸和亚油酸总含量高达85%，其特有的抗氧化物质，如芝麻酚（Sesamol）、芝麻素（Sesamin）、芝麻酚林（Sesamolin）具有降血压、抗氧化、抗癌等多种功能，被广泛应用于医药和临床[1]。但芝麻作为过敏原，有相当一部分人群对芝麻及其加工品存在过敏反应[2-3]，影响消费者的身体健康；同时芝麻产品因其丰富的营养价值和较高的销售价值，而成为不少不良商家的造假目标，据报道，造假商贩可以用香油精勾兑假香油，再加以香精和色素，消费者难以鉴别其真伪[4]；芝麻酱更是由用花生酱及少量香精勾兑而成。此类芝麻加工品完全不含有芝麻成分，严重损害了消费者的利益。因此，为确保消费者的身体健康及保障消费者的利益，急需建立芝麻及其产品的检测方法。

目前，对于芝麻产品的检测多为对造假香油的检测，鉴别造假香油的理化方法主要是对香精等化合物的检测，从而判断产品是否为造假产品。贾洪锋等[5]利用电子鼻对市售芝麻油中的芝麻香精成分进行了检测；秦早等[6]利用顶空固相微萃取结合气质联用技术分析芝麻油和芝麻香精的挥发性成分，以此对芝麻香精成分进行检测；李凝等[7]在芝麻油质量现状及掺假检测方法中叙述了显色法、紫外分光光度法、色谱法等。但化合物成分容易受到储藏环境、时间等因素的影响[6]，因此，理化方法检测具有一定的局限性。

随着现代生物技术的发展，运用分子生物学方法進行食品成分真伪鉴别已然成为备受关注的研究方向。韩建勋等[8]根据梨类甜蛋白基因内含子设计梨特异性扩增引物，建立梨成分的实时荧光PCR检测方法；ZHANG 等[9]基于棕榈油MT3-B序列，建立常规和实时荧光PCR方法，通过扩增109 bp的扩增子来检测棕榈油污染。

本研究旨在寻找芝麻物种特异性序列，并设计特异性引物，建立一套鉴别食品中芝麻成分的方法，为今后食品质量安全监管提供重要的技术依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

特异性鉴定样品白芝麻、黑芝麻、大豆、向日葵、花生，均购自超市；玉米、水稻、油菜籽、小麦由（河北农业大学食品科技学院）生物污染与动植物分子识别研究室保存；芝麻加工品芝麻油和芝麻酱购自超市。

1.2 主要试剂

新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根，DP320-03）；正己烷、异丙醇、醋酸钠（分析纯）；2×GoTaq Green Master Mix（Promega M7123）；DL 2 000 DNA Marker（宝生物工程有限公司）；琼脂糖凝胶（Biowest Agarose）；引物（苏州金唯智生物技术有限公司）。

1.3 试验仪器

分析天平（Mettler Toledo PL602-L）；恒温水浴锅（Neslab EX-111）；小型台式离心机（Thermo PICO 21）；超微量紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000）； PCR仪（ABI Veriti 96）；电泳仪（BioRad PAC 200）；凝胶成像仪（Azure c150）。

1.4 试验方法

1.4.1 DNA的提取与制备 （1）特异性鉴定样品DNA的提取。用新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根，DP320-03）：取600 μL缓冲液LP1于100 mg样品中，加入6 μL RNase A（10 mg·mL-1），漩涡振荡1 min，65 ℃中孵育40 min，每10 min颠倒混匀一次；加入150 μL缓冲液LP2，振荡1 min，12 000 g离心5 min，取300 μL上清移至新的2 mL离心管中，加入450 μL缓冲液LP3，颠倒混匀15 s；立即倒入吸附柱CB3中，12 000 g离心30 s，倒掉废液；加入600 μL漂洗液PW，12 000 g离心30 s，倒掉废液；重复上述漂洗操作。将吸附柱CB3放回收集管后，12 000 g离心2 min，倒掉废液，室温下放置5 min；将吸附柱CB3转入新的1.5 mL离心管中，在吸附膜中间部位滴加50 μL的ddH2O，室温放置5 min，12 000 g离心2 min，离心所得溶液即为样品DNA溶液。

（2）芝麻加工品基因组DNA提取。取100 mL芝麻油（30 mL芝麻酱）置于烧杯中，加入100 mL（30 mL）正己烷，磁力搅拌2 h，加入已65 ℃预热的裂解液（20 g·L-1 CTAB；81.82 g·L -1NaCl；100 mmol·L-1 Tris-HCl；20 mmol·L-1 EDTA；pH值 8.0）继续混匀2 h。将烧杯中溶液转入6个50 mL离心管中，10 000 g离心10 min分相；取120 mL水相，加入等体积异丙醇及0.1倍体积1 mol·L-1醋酸钠溶液，轻缓颠倒混匀，-20 ℃静置2 h，10 000 g离心10 min沉淀DNA，弃上清。加入400 μL TE缓冲液回溶，加入200 μL 氯仿∶异戊醇（24∶1）轻缓颠倒混匀，10 000 g离心5 min分层。将450 μL上清液转移至2 mL新离心管中，加入等体积异丙醇及0.1倍体积醋酸钠溶液，轻缓颠倒混匀，-20 ℃静置2 h后，10 000 g离心10 min沉淀DNA，弃上清。加1 mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，重复1次。干燥沉淀，50 μL ddH2O溶解。

1.4.2 引物特異性测试 利用设计的引物，分别以白芝麻、黑芝麻、玉米、水稻、大豆、向日葵、花生、油菜籽、小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增。

1.4.3 PCR扩增体系及程序的优化 根据引物特异性及扩增条带亮度确定最佳引物，对该引物以52，54，56，58，60，62 ℃为退火温度进行PCR反应扩增（10%，DNA模板50 ng·μL-1），并在5种退火温度下分别设置0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol·L-1等6个引物浓度梯度进行PCR扩增条件的优化。

1.4.4 引物灵敏度测试 将提取的芝麻基因组DNA用ddH2O进行梯度稀释，DNA浓度分别为100%，10%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%和0。利用优化后的PCR扩增条件进行扩增。

1.4.5 引物检出限的确定 取60份芝麻质量分数为0.1%的样品，提取基因组DNA，进行PCR扩增。

1.4.6 加工品测试 分别提取芝麻酱和芝麻油基因组DNA，25 μL体系加50 ng样品DNA，利用优化后的PCR扩增条件进行扩增。

2 结果与分析

2.1 序列分析及引物设计

根据HSIAO等[10]对编码芝麻种子贮藏蛋白的研究，获取Sesamum indicum 2S albumin-like序列（GI：747093087），通过NCBI-BLAST未见其他作物与之同源。利用Primer Premier 5软件设计3对芝麻物种特异性引物（表1）。

2.2 引物筛选

利用设计的3对引物，对9种特异性鉴定样品材料进行PCR扩增（图1），结果显示，引物sesame-2F/2R在以水稻基因组DNA为模板时出现非特异性扩增条带，说明其特异性较差。引物sesame-1F/1R和sesame-3F/3R只有黑、白芝麻样品出现目的片段，其他样品均未出现任何扩增片段，但引物sesame-1F/1R的扩增条带比引物sesame-3F/3R的亮，前者的扩增效率高于后者。因此，选择引物sesame-1F/1R进行后续试验。

2.3 PCR扩增体系及程序的优化

引物sesame-1F/1R在不同的退火温度（Tm值）和引物浓度处理中，扩增条带表现出不同的亮度（图2），当Tm值为60 ℃、引物终浓度为0.4 μmol·L-1时，扩增条带亮度明显高于其他条件，而且不随着引物浓度的加大而增加。

由图2可知，引物sesame -1F/1R的最适PCR反应体系为；1×GoTaqR Master Mix，0.4 μmol·L-1上游引物、下游引物，50 ng DNA模板（50 ng·μL-1），双蒸水补足25 μL；PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72℃充分延伸7 min，保存。由此可以建立芝麻物种特异性定性PCR方法，并对该方法进行灵敏度、检出限及加工品测试。

2.4 方法灵敏度测试

利用芝麻特异性引物sesame-1F/1R及优化后的PCR扩增条件，对不同浓度的DNA模板进行扩增。结果表明，当芝麻质量分数为0.1%及以上时，特异性目的片段条带清晰；当芝麻质量分数为0.1%以下时，扩增效果明显下降。因此，本方法的灵敏度为0.1%。

2.5 方法检出限测试

由图7可知，60份芝麻质量分数为0.1%的测试样品，均能稳定扩增出217 bp的目的片段，表明该方法的检测极限不高于0.1%。

2.6 加工品测试

根据1.4.1.2的方法提取芝麻酱及芝麻油DNA，并用超微量紫外分光光度（NanoDrop ND-1 000）对样品DNA浓度进行测定，其结果列于表2。

该方法选取芝麻油和芝麻酱作为芝麻加工品进行试验方法的验证。由图5可知，无论是何种性状的芝麻加工品，sesame-1F/1R经体系及程序优化后，对芝麻加工品进行PCR扩增，结果均能得到芝麻物种特异性基因扩增条带。

3 讨 论

物种特异性参照基因需要满足以下2个条件：该作物所有品种都存在该基因；其他生物没有或不存在扩增该基因的特异靶序列[11]。通过建立物种特异性PCR方法来检测食品加工品中的该物种，逐渐成为食品质量检测的重要手段[12-14]。本研究通过Sesamum indicum 2S albumin-like序列对比，结果发现Sesamum indicum cultivar Zhongzhi No. 13 linkage group LG11序列，并对其进行Blast对比及特异性分析，结果表明，该序列为芝麻物种特异性序列。

随着PCR技术的发展和对检测要求的不断提高，运用qPCR及dPCR技术可以对检测成分进行相对定量甚至绝对定量的测定[15-16]，但普通PCR方法与其相比，对设备要求不高，试验耗费更低，操作相对简单，技术更加成熟，因此，其应用更加广泛。根据《农业部2259号公告-4-2015 转基因植物及其产品成分检测 定性PCR方法制定指南》[17]，普通PCR产物长度宜为120～300 bp，而袁茵等[18]建立的芝麻酱成分真实性检测中设计芝麻物种特异性引物为66 bp，在凝胶电泳过程中不易与二聚体分开，故其不太适用于定性PCR检测。本研究所设计的扩增片段为217 bp的芝麻物种特异性引物，更适用于普通PCR法鉴定芝麻成分。

本试验所设计的引物sesame-1F/1R物种特异性良好，在优化后的扩增条件下能够检测出芝麻质量分数为0.1%的样品，芝麻加工品测试结果可信。因此，可以用来对芝麻加工品中芝麻成分进行检测。但为了定量检测食品加工品中的芝麻成分，本试验后续将进行实时荧光定量PCR方法的开发，为食品质量安全监管提供更有力的保障。

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