猪冷冻精液质量影响因素

黄文佳+金穗华

摘要： 本文从猪精液冷冻的过程入手，着重分析了精液稀释液中的添加剂，并探索了猪冷冻精液质量的影响因素。

关键词：猪冷冻精液；质量；影响因素

中图分类号： S828 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.09.039

人工授精是現代生物技术的一种，能够充分发挥公畜的遗传潜力，而精液冷冻是人工授精的重要环节，为人工授精提供了精子库。但是，人工授精要保证精液在冷冻之后的受精能力。猪冷冻精液质量受到冷冻前处理、稀释液、冷冻保护剂、解冻等各方面的影响。在冷冻之后，猪冷冻精液的细胞结构很可能发生改变精子的质膜完整性，精子活力和发育能力远远低于鲜活精子，因此猪精液冷冻技术要选用合适的稀释液和糖类，避免精子在冷冻过程主动形成冰晶，进而提高精子的活率，降低冷冻技术对精子质膜和顶体的影响。研究猪冷冻精液质量影响因素不仅能够优化精液冷冻技术，而且对人工授精的发展有着深刻的现实意义。

1 精液冷冻的过程

1.1降温

精液在冷冻的过程中需要降温处理，降温主要指精液温度从体温降低到冰点温度。而精液降温需要度过一定的危险温区，降温过程对精子的影响非常大，这种影响被称为低温打击。并且精子在解冻的过程中需要从冰点温度恢复到体温，而这个过程也需要经过危险温区，温度的变化会导致精子的活力下降。具体来说，低温打击会损害精子的代谢功能和精子的细胞膜，因为在降温过程中，精子的细胞膜结构发生了变化。温度降低会导致细胞膜中的磷脂类物质转移到温度较高的地方，精液从结晶状态转为凝胶状态，进而导致细胞膜结构发生变化。在解冻的过程中，磷脂类物质的转移会诱发精子顶体膜与细胞膜的结合，进而改变精子细胞周围的蛋白质环境，影响精子细胞蛋白质的活性。另外，低温打击还会影响精子细胞的其他功能，例如低温打击会损害精子顶体膜，降低细胞膜的通透性。

1.2冷冻与细胞损伤

在冷冻精液的过程中，当温度降低到零下5℃时，精子细胞内外的水分处于过冷状态而不会形成结晶。而随着温度的降低，当温度降低到零下10℃时，精子细胞外部的水分会形成结晶，而精子细胞内部的水分也开始固化。而冰晶会产生机械性刺激，损害精子细胞的固有结构。当温度降至在零下5℃～10℃之间时，冰晶会形成在精子细胞外面的电解质当中，细胞内的水分仍处于过冷状态，但是从精子细胞脱水的角度来说，精子冷冻过程中的细胞降温速度必须十分缓慢，允许精子细胞脱水的完全发生，进而避免精子细胞内部水分的固化。速度足够快的精子细胞脱水能够避免精子细胞处于高渗环境，而脱水严重会导致细胞分子的极端收缩，损害精子。另外精子细胞外部水分形成冰晶之后会缩小精子细胞的空间，对精子细胞造成机械性伤害，这种机械性伤害无法弥补。除此之外，在冷冻的过程中需要在精液稀释液中添加冷冻保护物质，避免精子细胞内冰晶的形成。常用的冷冻保护物质是甘油，甘油的渗透性较强，能够降低精子细胞内水分的含量可以渗入到精子细胞内，调节精子细胞由脱水而产生的渗透压变化。

2 精液稀释液中的添加剂

为提高精子在冷冻之后的受精能力，相关人员对精子冷冻技术进行了深入研究。在大量的研究中，相关人员发现某些物质可提高精子在冷冻后的运动能力，延长精子解冻后的生存时间，使精子在输卵管内运动，提高授精率，因此在冷冻精子的过程中，技术人员常在精液稀释液中添加能够提高精子活力、延缓精子衰老的物质，这些物质主要包括咖啡因、氨基多糖、己酮可可碱、细胞因子、维生素等。

2.1咖啡因

处理精子的过程中，在精液稀释液中加入咖啡因能够有效提高解冻之后，精子的体外受精率和精子的活力。在解冻精子进行体外受精的过程中，需要应用流式细胞仪对精子实行细胞分离，在这个过程中，咖啡因能够有效保证体外受精。因为咖啡因能够抑制精子细胞中的磷酸二酯酶的活性，提高精子内的cAMP浓度，促进精子顶体反应发生，进而实现体外受精。但是，咖啡因会影响受精卵的早期发育，因此在受精卵形成之后需要采用离心方式去掉受精卵中的咖啡因，保证受精卵健康发育。

2.2氨基多糖类

一是肝素经常用于诱导动物精子体外获能，肝素与精子结合能够使钙离子进入精子细胞内，进而促进精子的顶体反应，提高精子的受精率；二是透明质酸属于现行大分子多糖物质，能引起动物精子顶体反应和动物精子获能。透明质酸存在于雌性动物的生殖道内，促进体内受精。在处理体外受精的过程中，在精液稀释液中加入透明质酸能够提高精子的存活率。

2.3己酮可可碱

己酮可可碱是当前生物技术行业十分重视的精子体外处理剂，能有效增强解冻后的精子活力，改善解冻后质量较差的精子。己酮可可碱在体外受精技术中应用十分广泛，效果较好。己酮可可碱不仅能影响精子的顶体反应和运用能力，而且能刺激精子的运动，使精子在一段时间后仍保持被刺激的运动。另外，己酮可可碱能增强精子的受精力，提高体外受精的几率。

2.4生殖激素

在精液稀释液中加入生殖激素可有效提高精子的受精几率，孕酮能够诱发精子的顶体反应。孕酮使精液中的钙离子流进精子内部而发生顶体反应。另外，研究发现，浓度适当的孕酮增强精子的穿卵能力，提高人工授精的成功率。

2.5细胞因子

血小板活化因子被广泛运用于生物学，是一种活性较强的甘油磷脂，与哺乳动物的排卵、受精、胚胎发育、分娩等生殖过程有着密切联系。血小板活化因子与磷脂相关，能够诱导精子发生顶体反应，提高卵细胞的体外受精率，并且血小板活化因子能够提高精子的运动速度，增强精子活力。

3 猪冷冻精液质量的影响因素

3.1稀释液与冷冻保护剂的影响

稀释液是精子在冷冻过程中的保护剂，决定了精液的冷冻效果。常用的精液稀释液主要由糖、脂质、蛋白质、添加剂、缓冲液、防冻剂等成分组成。而常见的稀释液主要包括甘油、卵黄、糖类和缓冲物质及其他添加物质等。其中甘油是最重要的冷冻保护剂，能够深入精子细胞内部，结合或浓缩精子细胞内部的水分。甘油也有一定的稀释作用，能降低稀释液中的浓度，减小冷冻液的渗透压，进而保护处于低温的精子。但甘油对精子也有一定的负面作用，甘油的浓度、温度等对猪精子在冷冻之后的存活率有着重要影响，需要冷冻技术人员合理把握添加甘油的时机和甘油的浓度。卵黄能够有效维持精子的活力，充分保护精子的顶体膜。卵黄的渗透性和缓冲性较强，能使精子承受高渗和低渗。在冷冻技术中，稀释液中的卵黄浓度约为20%左右。精液稀释液中的糖类物质主要有果糖、葡萄糖和乳糖，糖类物质能利用自身的渗透性保护细胞，抵抗低温。但高浓度的糖类物质会低效甘油对精子顶体的伤害，提高精子的活力。另外，葡萄糖在精液稀释液中的保护效果很好。其他添加物质主要包括HA、HBCD、OEP等物质。HBCD能增加解冻后精子的运动速度，HA能增强精子脂质膜的稳定性。

3.2冷冻前处理影响

猪精子在迅速冷却时会失去活力，当精液在采集之后迅速冷却到5℃或0℃时，会失去活力，这种现象被称为冷休克。猪精子对冷休克十分敏感，需要在冷冻前进行处理。猪精子在用低倍数稀释液稀释并缓慢降温1～5小时之后，才具备一定的抗冻能力。猪精液冷冻需要数个小时，平衡在15℃以上，才能够保证精液在冷冻之后具备受精能力。

3.3冷冻剂影响

一是安瓿瓶法。安瓿瓶法主要使用硅酸盐硬质玻璃支撑的容器盛装猪精液，计量为0.5毫升或1.0毫升。从20世纪50年代开始，猪精液冷冻便开始采用安瓿瓶法。安瓿瓶法的优点是剂量标准、密封性强、标记明显，不需要使用解冻溶液，精子的复苏率较高，但是安瓿瓶法也有与一定的缺陷，制作成本较高，容易破裂，体积较大。目前，猪精液冷冻已经很少使用安瓿瓶法；二是颗粒冷冻法。颗粒冷冻法主要指将经过预处理的猪精液滴入干冰内，进而使猪精液快速冷冻。目前，颗粒冷冻法在猪精液冷冻保存中的应用十分广泛。颗粒冷冻法主要包括快速制冻法和缓慢制冻法；三是细管法。细管法主要将稀释之后的猪精液装入大型细管之中，并将细管密封放在液氮上冷冻。运用细管法冷冻之后的猪精子在解冻之后的存活率低于颗粒法，但是细管法冷冻的猪精子受胎率高于颗粒法。细管法的体积较小，容易存放，精子利用率也高，在精液冷冻保存中应用比较广泛；四是铝箔袋法。铝箔袋法主要将经过两次稀释之后的猪精液放入铝箔袋内，封印并用液氮蒸汽冷冻。

3.4冷冻速率影响

在冷冻过程中，猪精子细胞不仅要承受保存温度，还要承受温度的变化。猪精子细胞有其理想的解冻和冷冻速率，如果冷冻速率太慢，猪精子与冷冻保护剂接触的时间过长，会导致猪精子易受到冷冻保护剂的破坏而死亡。但是，如果冷冻速率过快，猪精子细胞在冷冻的过程中会产生细胞内液体结晶現象，对猪精子细胞造成化学或物理损伤。

3.5解冻影响

精子细胞在冷冻过程中需要经受温度的挑战，忍受致死温度区，而精子细胞在解冻过程中还需要接受温度的挑战，经历致死温度区，而且不同细胞的解冻速率不同。含有精子的冷冻液冷冻到冰点左右时，冷冻液会结冰，但是精子内部的物质并不一定会结冰。精子内部的膜质会与妨碍冰晶的扩张，导致液体在精子细胞内外流动。当温度下降时，过冷的精子细胞水分会受到细胞外的渗透压力渗出精子细胞外。精子细胞水分的渗透率会受到细胞因素的影响，尤其是特定温度下精子细胞膜对甘油和水的渗透率的影响。精子细胞冷冻技术利用外部因素来调节细胞水分渗透的方法是通过控制猪精液冷冻速率或添加冷冻保护剂完成的。如果冷冻速率够慢，精子能够通过细胞外部的渗透压力来减少精子细胞内部的水分，避免精子细胞内部大冰晶的形成。如果冷冻速率过快，精子细胞内部的水分将无法渗出，产生大冰晶。另外，如果解冻速率过慢，猪精子与解冻液的接触时间过长而受到解冻液破坏，如果解冻速率过快，猪精液很容易出现没有完全解冻的现象，从而影响猪精子的活力。

参考文献

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作者简介：黄文佳，本科学历，助理工程师，研究方向：遗传育种。

通讯作者：金穗华，高级畜牧师，研究方向：家畜繁殖与家畜精液质量检验技术等。