分光光度法分析水果酵素中功效酶活性的研究

陈 爽,朱忠顺,高妍妍,朱显峰

(河南大学生命科学学院生物工程研究所,河南开封 475004)

分光光度法分析水果酵素中功效酶活性的研究

陈 爽,朱忠顺,高妍妍,朱显峰*

(河南大学生命科学学院生物工程研究所,河南开封 475004)

目的:利用分光光度法分别测定水果酵素中多种功效酶的活性。方法:借助分光光度计,采用3,5-二硝基水杨酸法、福林法、铜皂法和邻苯三酚终止法分别对液状水果酵素中淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及超氧化物歧化酶的活力进行测定。结果:液状水果酵素中淀粉酶活力为1.968 U/mL,蛋白酶活力为5.421 U/mL,脂肪酶活力为1.106 U/mL,超氧化物歧化酶活力为10.758 U/mL。结论:液状水果酵素中SOD酶活性最高,蛋白酶次之,淀粉酶和脂肪酶活性较低;后续实验中可优化发酵条件来提高其中的淀粉酶与脂肪酶活力。

水果酵素，淀粉酶,蛋白酶,脂肪酶,超氧物歧化酶,酶活力

“诺贝尔化学奖得主波以尔教授说:如果人像灯泡,酵素就是电流,没有电流(酵素)灯泡就不亮。没有酵素就没有生命”[1]。酵素有个正式的名字——酶,它的产生类似酿酒,由微生物以水果为底物发酵产生;并且在微生物代谢的过程中产生了多种活性物质,如各种有机酸、酚类、氨基酸、维生素、矿物质、酶等[2]。身体中酵素的多少及其活性高低和人体的衰老与疾病息息相关。随着年龄的增加,人体内的酵素数量与活力都在下降[3]。而液状水果酵素的制作卫生环保,因此,可通过食用酵素来调节体内酶的含量,进而预防现代文明病、解酒护肝、美容[4]。另一方面,酵素在食品和医药等领域中具有很广泛的应用,一些生物酵素产品开始应用于农牧业中[5-7]。

功效酶是水果酵素中的主要活性物质之一,其中,蛋白酶可水解蛋白质肽链,食物摄取的蛋白质可以被体内的蛋白酶分解为易于被人体吸收的氨基酸,增加体内的营养吸收;在面包生产中能改变面筋性能[8]。其中胰蛋白酶可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散,胃蛋白酶能消化食物中的蛋白质,如向豆饼饲料中添加蛋白酶,可以增强保育猪对豆饼中氨基酸的消化[8]。淀粉酶通常能够把糖类催化水解为易于人体吸收利用的小分子物质,对于动物包括人类有增强消化的功能。据孟庆红报道,α-淀粉酶在面包生产工艺中有助于面包的起发,在焙烤工艺中可增大面包体积、提高面包柔软度、延缓面包老化速度[9]。有文献指出一些耐热性相对较低的细菌α-淀粉酶是有效的抗老化剂[10]。脂肪酶能够逐步将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸,也可非专一降解壳聚糖以及水-有机界面间的不溶底物[11-12];超氧物歧化酶(SOD)是生物体系中抗氧化酶系的重要成员,专一催化超氧阴离子发生歧化反应,有效防御生物体内活性氧对机体的伤害,可作为食品抗氧化剂或蔬菜水果的保鲜剂,对自身免疫病、心脑血管疾病等都有显著疗效[13-14],还可延缓皮肤衰老、祛色斑[9]。

功效酶的活力是水果酵素的主要质量指标,目前对酵素中功效酶的活性检测较少,其中有相关文献报道了微生物酵素中3种功效酶的活力,然而其种类不够全面[15]。本文系统的研究了水果酵素中主要功效酶的活力,完善了酶的测定种类及液状水果酵素中酶活性与样品浓度的关系。测定水果酵素功效酶的活性,可以更加有据的评价酵素的质量,提高人们对酵素的认可度,若能通过使用水果酵素来增加各种酶的功效,将对开发利用水果酵素保健食品、日化产品、化妆品、医药及环境治理的应用等有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

国产红提、红富士苹果、库尔勒香梨、香橙、蜜柚、国产火龙果、香蕉、柠檬、猕猴桃、白砂糖 均为市售优品;麦芽糖、可溶性淀粉、氢氧化钠、硫酸铵、柠檬酸、柠檬酸钠、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钠、Folin-酚、三氯乙酸、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、L-酪蛋白、L-酪氨酸、醋酸铜、吡啶、油酸、甲苯、盐酸、Tris、邻苯三酚、抗坏血酸 以上试剂均为分析纯;金龙鱼精炼一级大豆油 市售。

Eppendorf 5810R台式高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司;INESA 752N紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;其他仪器 验室常规仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 液状水果酵素的制备 将水果洗净、晾干后分别称重,其中国产红提300 g,红富士苹果600 g,库尔勒香梨250 g,香橙250 g,蜜柚250 g,国产火龙果250 g,香蕉100 g,柠檬200 g,猕猴桃200 g。将白砂糖、水果和水按照1∶8∶10的比例放入发酵罐,把罐体密封好置于阴凉处(室温25～30 ℃)发酵,每隔3 d于无菌操作台中通气一次,实验过程中通过紫外照射操作台避免染菌,罐体表面及取样口用75%酒精消毒,静置发酵30 d。对发酵完成的液状水果酵素置于超净工作台中进行无菌取样,以4000 r/min、6 ℃条件下离心10 min后取上清液,按7∶13(v∶v)加入饱和硫酸铵,4 ℃条件下盐析2 h后的上清液即为粗酶液,保存备用。

1.2.2 淀粉酶活力的测定

1.2.2.1 标准曲线的制作 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖,而麦芽糖与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸,可在520 nm测定其吸光度,从而计算出发酵液中淀粉酶活力[15]。按照表1的操作,在波长520 nm处测定溶液的吸光度,以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

表1 淀粉酶标准曲线的制作Table 1 The standard curve making of amylase

1.2.2.2 活力的测定 分别将0.5 mL磷酸缓冲液、粗酶液于50 ℃水浴中预热3 min后混匀，加入2 mL 1%的淀粉溶液，50 ℃水浴反5 min立即加入4 mL已在沸水浴中预热的3,5-二硝基水杨酸试剂，摇匀后于沸水浴中反应10 min；以1 mL蒸馏水代替麦芽糖标准液，作空白实验。按标准曲线计算酶的浓度，然后以靳利娥[16]等的公式计算酶活力(U/mL)，如下：

X=c×V×n

式中，X为淀粉酶活力，U/mL；c为酶液中麦芽糖的浓度，μmol/mL；V消耗的粗酶液的体积，mL；n为酶液的稀释倍数。

1.2.3 蛋白酶活力的测定

1.2.3.1 标准曲线的制作 参照GBT 23527-2009《蛋白酶制剂》[17],试剂的添加如表2所示，40 ℃水浴20 min,在波长680 nm处测得反应液的吸光度,以L-酪氨酸浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

表2 蛋白酶标准曲线的制作Table 2 The standard curve making of protease

1.2.3.2 活力的测定 分别取40 ℃预热5 min的1%酪蛋白与经同样预热的不同浓度粗酶液1 mL,于试管中40 ℃水浴反应10 min后,立即依次加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL,摇匀后静置10 min,用慢速定性滤纸进行过滤,取滤液1 mL依次加入5 mL Na2CO3溶液与1 mL Folin-试剂,40 ℃水浴显色20 min后,在680 nm处测定吸光度值。对照实验测定方法同上,唯在反应之前要先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL,使酶失活。参照标准曲线,计算酵素中蛋白酶的活力[18]。

1.2.4 脂肪酶活力的测定

1.2.4.1 标曲的制作 脂肪酶活力采用铜皂法进行测定[19]。按照表3添加试剂混合搅拌3 min后，4000 r/min离心10 min,取上层有机相测710 nm处吸光度值,以吸光度对油酸浓度作图得到脂肪酶的标准曲线。

表3 脂肪酶标准曲线的制作Table 3 The standard curve making of lipase

1.2.4.2 活力的测定 根据脂肪酶分解大豆油产生的油酸分子与醋酸铜中的Cu2+生成绿色的络合物,以4000 r/min转速离心10 min后取上层有机相在710 nm处测定吸光度。分别取37 ℃水浴预热5 min的3 mL磷酸盐缓冲液与1 mL大豆油,混合磁力搅拌10 min,立即加入0.1 mL粗酶液,搅拌2 min后加8 mL甲苯,终止反应,同时萃取生成的脂肪酸。将反应液4000 r/min离心10 min,取上层有机相4 mL加入1 mL 5%醋酸铜显色剂,磁力搅拌3 min,同条件离心10 min,取上层有机相,在波长710 nm处测其吸光度。以不含脂肪酶的空白溶液作参比,对照脂肪酸吸光度标准曲线,即可求得脂肪酸的浓度。

将一定条件下,每分钟释放出1 μmol脂肪酸的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。脂肪酶活力的计算参照江慧芳[19]的方法进行,如下公式:

X=(cV1)/(tV2)

式中,X为脂肪酶活力,U/mL;c为脂肪酸的浓度,μmol/mL;V1为脂肪酸溶液的体积,mL;t为作用时间,min;V2为消耗的粗酶液的体积,mL。

1.2.5 超氧物歧化酶(SOD)的活力测定 采用邻苯三酚终止法[20-21],当邻苯三酚自氧化反应后,于25 ℃水浴中迅速加入5%维生素C溶液,立即混匀、静置,以终止自氧化反应,然后再测定反应液在325 nm处的吸光度。其中邻苯三酚自氧化速率与SOD活性的测定依表4进行;SOD活力的计算参照许雅娟[21]的方法,如下公式:

X=(A0-Ai)/A0×18/V×N

式中,X为SOD活力,U/mL;A0为邻苯三酚的自氧化率;Ai为反应液的吸光度;V为消耗的粗酶液的体积,mL;N为粗酶液的稀释倍数。

表4 邻苯三酚自氧化速率的测定Table 4 The detection of pyrogallol oxidation rate

1.3 数据处理

根据测得的各实验数据,由酶活力公式计算出各种酶的活力,经Origin软件进行数据分析,并选择一组线性相关较高的数据,即r在0.885～0.999范围内的一组数据绘制酶活力随粗酶液浓度的变化曲线。

2 结果与分析

2.1 淀粉酶活力测定

2.1.1 标准曲线的制作 在波长520 nm处测得反应液的吸光度,以加入麦芽糖的质量含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线y=0.41167x-0.02252,R2=0.99724,见图1。

图1 麦芽糖标准曲线Fig.1 The standard curve of maltose

2.1.2 淀粉酶活力测定 以可溶性淀粉为底物,利用分光光度法测得淀粉酶活性,绘得各组酶活力测定曲线,由图2可知,淀粉酶活性随样品浓度的增长而快速增长,当酶液浓度为10%左右时,淀粉酶活性最高,为1.968 U/mL。之后酶活性趋于稳定,可能是底物浓度太低,添加的酶量已将其完全催化所致,有待以后研究。

图2 淀粉酶活性测定曲线Fig.2 The activity curve of amylase

2.2 蛋白酶活力测定

2.2.1 标准曲线的制作 借助分光光度计测得680 nm处的标准酪氨酸吸光度值,绘制酪氨酸标准曲线y=0.01061x+0.00595,其中R2=0.99928,说明酪氨酸与产物——蓝色钼蓝和钨蓝的混合物呈现很好的线性关系,可以用此方法进行蛋白酶活力的测定,见图3。

图3 酪氨酸标准曲线Fig.3 The standard curve of tyrosine

2.2.2 蛋白酶活力测定 以L-酪蛋白为底物,采用分光光度法测得蛋白酶活性测定曲线,由图4可知,随酶液浓度的增加,蛋白酶活性基本呈线性、稳定增长,当粗酶液浓度为12%时,蛋白酶活力达到5.421 U/mL;因此可通过改变酵素液浓度的方式来改变其中的蛋白酶活力,进而可选择不同浓度来应用于食品、化妆品及其他领域。由此也证明用酪氨酸做底物、以福林法测定水果酵素中蛋白酶的活力方法简便,不易使液体状态中的酶失活,结果可信度高。

图4 蛋白酶活性测定曲线Fig.4 The activity curve of protease

2.3 脂肪酶活力测定

2.3.1 标准曲线的制作 实验中分别以75%酒精、无水乙醇及正己烷来作为油酸溶液的溶剂,其中只有后者可以很好的相容,另两者均出现不同程度的分层,不利于实验的进行,因此选用正己烷作溶剂来进行实验。通过测定油酸-正己烷溶液与醋酸铜的反应液在710 nm处的标准油酸吸光度值,得到油酸的标准曲线y=0.0653x+0.2728,其中R2=0.98461,线性良好,可以由此来测定脂肪酶的活力,如图5。

图5 脂肪酶标准曲线Fig.5 The standard curve of oleic acid

2.3.2 脂肪酶活力测定 以市售大豆油为底物,采用分光光度法测得脂肪酶活力的变化曲线,由图6可知,虽然脂肪酶活力随酶液浓度的升高而递增,但是水果酵素中脂肪酶活力依然很低,当粗酶液浓度为12%时,脂肪酶活力仅能达到1.106 U/mL,因此可对酵素液进行浓缩,来增加脂肪酶的活力,或者以后优化实验条件来提高水果酵素中脂肪酶的活力,进而扩大其在化妆品、保健产品、环境治理等方面的应用性。

图6 脂肪酶活性测定曲线Fig.6 The activity curve of lipase

2.4 SOD活力测定

以5%的VC为底物,在325 nm处用邻苯三酚终止法得SOD酶活性测定曲线,酶活力变化由图7可知,随着样品浓度的增加,SOD酶活性基本呈线性增长(r=0.99);水果酵素浓度越高,其中的SOD活力越大;当粗酶液浓度为12%时,液状水果酵素SOD活力达到10.758 U/mL,即对超氧阴离子的清除能力很强,证明液状水果酵素的抗氧化能力较好。本研究可为大力开发微生物蛋白酶与SOD这一条很有前景的产业方向做好铺垫。

图7 SOD酶活性测定曲线Fig.7 The activity curve of SOD

3 结论

本实验通过对液状水果酵素中淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、SOD酶活力的测定,发现水果酵素中淀粉酶活力为1.968 U/mL,蛋白酶活力为5.421 U/mL,脂肪酶活力为1.106 U/mL,SOD酶活力为10.758 U/mL。其中SOD活性较高,蛋白酶次之,淀粉酶和脂肪酶活性较低;水果酵素中脂肪酶活力虽然较低,但可对酵素液进行浓缩,来线性增加脂肪酶的活力,提高其在去污、降脂等方面的应用性。直接测定液体酵素中功效酶的活力,避免了对产品加工过程中可能造成的酶活性改变,使实验结果准确度更高,能为酵素的应用奠定更科学的理论基础。

[1]于晓艳,任清,卢舒娴,等. 微生物酵素主要功效酶活力的测定[J]. 食品科技,2008,33(7):193-196.

[2]毛建卫,吴元峰,方晟. 微生物酵素研究进展[J]. 发酵科技通讯,2010,39(3):42-44.

[3]王慧超,陈今朝,韩宗先.α-淀粉酶的研究与应用[J]. 重庆工商大学学报:自然科学版,2010,27(4):368-372.

[4]陈安安. 小小酵素,女性健康的守护天使[J]. 分忧,2015(6):52-53.

[5]刘丽华,张艳梅,王景芳,等. “动物酵素营养液” 在家禽饲养上应用效果[J]. 2014(11):294-295.

[6]Cowieson A J,Roos F F. Toward optimal value creation through the application of exogenous mono-component protease in the diets of non-ruminants[J]. Animal Feed Science and Technology,2016.

[7]邹伟才,崔淑辉,曾光辉,等. 酵素对有机水稻的影响[J]. 安徽农业科学,2015,43(8):62-63.

[8]孟庆红. 淀粉酶的作用机理及在面包和饲料中的应用[J]. 粮食与饲料工业,1997(6):34-34.

[9]刘传富,董海洲. 淀粉酶和蛋白酶及其在焙烤食品中作用[J]. 粮食与油脂,2002(6):38-39.

[10]肖春玲. 微生物脂肪酶的研究与应用[J]. 微生物学杂志,1997,17(4):56-59.

[11]王丽娟,夏文水,陈小娥,等. 脂肪酶水解壳聚糖作用研究[J]. 食品工业科技,2004,25(5):51-53.

[12]陈祥娥,凌沛学,张天民. 超氧化物歧化酶的应用[J]. 食品与药品,2013,15(4):283-286.

[13]徐颢溪. 超氧化物歧化酶综合利用研究进展[J]. 园艺与种苗,2014(8):59-62.

[14]于晓艳,任清,卢舒娴,等. 微生物酵素主要功效酶活力的测定[J]. 食品科技,2008,33(7):193-196.

[15]张剑,林庭龙,秦瑛,等.β-淀粉酶研究进展[J].中国酿造，2009,205(4):5-8.

[16]靳利娥,吕光成. 发芽黄豆β-淀粉酶活力的测定与比较[J]. 食品科技,2004(6):82-84.

[17]QB/T 23527-2009. 蛋白酶制剂[S]. 2009.

[18]杨旭,屈小玄,郭庆贺,等. 牛奶中蛋白酶活力测定的方法比较[J]. 中国乳品工业,2014,42(6):48-51.

[19]江慧芳,王雅琴,刘春国. 三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进[J]. 化学与生物工程,2007,24(8):72-75.

[20]静天玉,赵晓瑜. 用终止剂改进超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法[J]. 生物化学与生物物理进展,1995,22(1):84-86.

[21]许雅娟,赵艳景,胡虹. 邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究[J]. 西南民族大学学报:自然科学版,2008(6):1207-1209.

Detection of efficacy enzyme activity in ferments of fruits by spectrophotometric method

CHEN Shuang,ZHU Zhong-shun,GAO Yan-yan,ZHU Xian-feng*

(College of Life Sciences Institute of Biological Engineering,Henan University,Kaifeng 475004,China)

Abjective:The efficacy enzyme activity in ferments of fruits was detected by spectro-photometric. Methods:In this study,by means of 3,5-dinitrosalicylic acid,folin method,copper soap method and pyrogallol autoxidation method,the activies of amylase,protease,lipase,and superoxide dismutase of fruit enzymes was performed respectively by a spectrophotometer. Results:The activities of amylase,protease,lipase and superoxide dismutase was 1.968 ,5.421,1.106,10.758 U/mL of fruit enzymes,respectively. Conclusion:The activities of superoxide dismutase was highest,then was protease activities,the activities of amylase and lipase in fruit-ferments was lower than them. The results obtained in this study should be helpful for optimum fermentation condition in order to receive a high activity in further research.

ferments of fruits;amylase;protease;lipase;superoxide dismutase;enzyme activity

2016-08-29

陈爽(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：生物物质分离，E-mail：chans_9009@163.com。

*通讯作者:朱显峰(1973-)，男，教授，主要从事微生物与生化药学方面的研究，E-mail：zhuxf73@163.com。

教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(20124103120002)；河南省科技攻关计划项目(132102310421)；河南大学研究生优秀学位论文培育计划(理学硕士)(Y1425010)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0218-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.034