树莓酵素中耐高渗酵母菌的分离鉴定及生长特性研究

王珍珍,沙如意,*,蔡成岗,蒋增良,方 晟,程勇杰,樊 凡,毛建卫,*

(1.浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江杭州 310023; 2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江杭州 310023; 3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,浙江杭州 310023; 4.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058; 5.绍兴文理学院元培学院,浙江绍兴 312000)

树莓酵素中耐高渗酵母菌的分离鉴定及生长特性研究

王珍珍1,2,3,沙如意1,2,3,*,蔡成岗1,2,3,蒋增良4,方 晟5,程勇杰1,2,3,樊 凡1,2,3,毛建卫1,2,3,*

(1.浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江杭州 310023; 2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江杭州 310023; 3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,浙江杭州 310023; 4.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058; 5.绍兴文理学院元培学院,浙江绍兴 312000)

从树莓酵素中分离酵母菌,通过形态学特征、生理生化指标及26S rDNA序列分析进行鉴定,并对其生长特性进行研究,以期为植物酵素食品生产提供酵母菌资源。鉴定结果表明:分离出的Y1、Y2、Y3三株菌形态学特征相似,且均可在高糖环境下生长,26S rDNA序列与鲁氏接合酵母的同源相似性均高于99%,确定Y1、Y2、Y3均为鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii,Z.rouxii);生长特性研究结果表明:当培养基初始葡萄糖含量为300、450、600、750 g/L时,该菌种均可生长,延滞期分别为12、12、36、60 h,葡萄糖初始含量为900 g/L,生长缓慢;当培养基初始pH为1.5和2.0时,菌种的生长受到抑制,当pH为2.5、3.0、3.5时,菌种可以生长,延滞期分别为96、48、48 h。鲁氏接合酵母为树莓酵素中的优势酵母,具有耐高糖、耐低pH等耐高渗特性。

树莓酵素,耐高糖,耐低pH,鲁氏接合酵母

植物酵素(Plant Jiaosu)是以一种或多种新鲜蔬菜、水果和谷豆类、海藻类、食药两用本草类、菌菇类等食材为原料,加(或不加)糖类物质,经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性微生物发酵产品,拥有丰富的次生代谢产物、植物本身营养成分和益生菌等功能成分，特别是富有小分子功能成分,研究表明该类产品具有抗衰老、抗菌消炎、净化血液、增强机体免疫能力及解毒抗癌等多种保健功能[1-5]。植物酵素生产方法主要是自然发酵,随着现代发酵技术的发展,外接已知菌种如酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等进行外接菌种发酵和复合发酵的技术逐渐应用于酵素产品的生产。但是可用于植物酵素发酵的菌种较少,从自然发酵的酵素产品中分离优势菌株的研究报道也较少。蒋增良等[2]从自然发酵的葡萄酵素中筛选到优势酵母:季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、德巴列汉逊酵母(Debaryomyceshansenii)和浅白隐球酵母(Cryptococcusalbidus)等。从自然发酵的酵素产品中筛选优势菌种,对于研究发酵机理、功能成分代谢、产品生产及质量控制等方面具有重要的意义。

树莓果实多浆,味酸甜,果实中富含维生素C、原花青素、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素、超氧化物歧化酶(SOD)、氨基酸、鞣花酸[6-10]等功能成分,以树莓为原料制备的树莓酵素,具有很高的营养与保健价值。前期研究表明,树莓酵素自然发酵过程中,其发酵原液具有高糖,低pH,较高的抗氧化活性等特点[2]。本文从树莓酵素原液中筛选优势酵母菌,通过形态学鉴定、生理生化实验及26S rDNA序列分析等,对筛选菌株进行菌种鉴定,通过耐高糖实验和耐低pH实验,对筛选菌株的生长特性进行研究,旨在为植物酵素的发酵过程研究、工业化生产提供优质的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

树莓酵素原液 发酵3年,还原糖含量:780 g/L,pH3.17,由浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室提供;从样品中分离筛选出酵母菌 菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC12131,基因序列已上传到GenBank数据库,编号为KT956240;实验中所用到的常规化学试剂 国药集团化学试剂有限公司(上海,中国)和上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

MB-150CL恒温恒湿培养箱 青岛明博环保科技有限公司;SW-CJ型超净工作台 无锡易纯净化设备有限公司;TS-2102C小型立式恒温摇床 上海天呈实验仪器制造有限公司;YXQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SMART型显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司;Allegra X-12R冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 培养基配制

PDA培养基:将马铃薯去皮切块,加1000 mL蒸馏水,煮沸10～20 min。用纱布过滤,补加蒸馏水至1000 mL。加入葡萄糖和琼脂,加热溶化,分装后,121 ℃灭菌30 min[11]。

YEPD培养基(g/L):酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1000 mL,pH6.0,121 ℃湿热灭菌30 min[11]。

碳源基础培养基:(NH4)2SO45 g,KH2PO41 g,MgSO4-7H2O 0.5 g,CaCl2-2H2O,0.1 g,NaCl 0.1 g,酵母膏0.2 g,加蒸馏水至1000 mL,糖或其它碳源5 g。115 ℃灭菌30 min[12]。

氮源基础培养基:葡萄糖20 g,KH2PO41 g,MgSO4-7H2O 0.5 g,酵母膏0.2 g,水洗琼脂20 g,加无氨蒸馏水至1000 mL,加待测氮源0.5%,115 ℃灭菌20 min[12]。

无维生素培养基:葡萄糖20 g,(NH4)2SO45 g,KH2PO41 g,MgSO4-7H2O 0.5 g,CaCl2-2H2O 0.1 g,NaCl 0.1 g,加蒸馏水至1000 mL,115 ℃灭菌20 min[12]。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母菌的分离纯化 用梯度稀释法,将样品涂布于PDA培养基平板上进行酵母菌株的分离纯化[2],直至在显微镜下观察为纯菌株为止。纯化好的菌株转接于斜面保存待用。

1.3.2 形态特征鉴定 菌落形态观察:将纯化好的单菌落接种于PDA固体培养基和PDA液体培养基,于28 ℃恒温培养箱培养72 h,记录菌落大小、形状、颜色、液面是否有菌醭或菌岛,底层是否有沉淀等。

显微观察:挑取少许PDA固体培养基上单菌落于载玻片上,用灭菌生理盐水稀释,加盖玻片,于目镜10×,油镜100×条件下观察细胞形态,记录菌体大小、形状、繁殖方式。

1.3.3 生理生化特征鉴定 菌株生理生化特征鉴定:依据《酵母菌的特征及鉴定手册》[13]和《微生物学实验手册》[12]设计,主要包括:糖发酵鉴定、碳源同化实验、氮源同化实验、无维生素培养基上的生长实验、耐高渗透压的测试、产生类淀粉化合物测定等。

1.3.4 分子生物学鉴定

1.3.4.1 26S rDNA序列测定 按Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒(SK8257)操作,采用酵母菌26S rDNA基因通用引物,引物序列为:NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGG AAAAG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。PCR扩增条件:94 ℃,预变性4 min;94 ℃,变性45 s;55 ℃,退火45 s;72 ℃,延伸1 min,循环30次;72 ℃,修复延伸10 min,4 ℃保温。PCR反应体系(25 μL体系):Template(基因组DNA 20～50 ng/μL)0.5 μL;10×Buffer(含 Mg2+)2.5 μL;dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL;酶 0.2 μL;F(10 μmol/L)0.5 μL;R(10 μmol/L)0.5 μL;最后加双蒸水至25 μL。取5 μL扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳,150 V,100 mA,20 min条件下电泳观察,扩增成功,将会在600 bp左右出现明亮的条带。PCR扩增得到的序列测定在上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

表1 分离菌株的形态特征观察表Table 1 Morphological characteristics of the yeast strains

1.3.4.2 同源性分析与系统发育树的构建 根据测序结果,利用BLAST软件从GenBank核酸序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行同源序列搜索(BLAST search),比较供试菌株与已知酵母菌相应序列的相似程度。根据同源序列搜索结果,使用MEGA6软件进行多序列对位排列,并采用MEGA6软件包中neighbour-joining方法构建系统发育树,Boostrap值的计算分析根据1000次随机抽样进行[14]。

1.3.5 耐受性实验 菌种活化:将纯化好的单菌落接种于YEPD液体培养基,于28 ℃恒温培养箱培养1 d,制成107CFU/mL的菌悬液。

1.3.5.1 生物量-吸光度标准曲线的绘制 取1 mL活化好的菌液,接种于起始葡萄糖浓度为300 g/L的YEPD液体培养基,于28 ℃下恒温培养2 d,分别取5、10、20、25、35 mL,于50 mL的离心管中,10000 r/min离心10 min,倾去上清液,将得到的2组菌体沉淀中的一组烘干、称重。另一组用去离子水定容到50 mL容量瓶中,测定OD600,做三个平行,绘制生物质干重-吸光度的标准曲线。

1.3.5.2 高糖耐受性实验 按3%的接种量,分别接种于起始葡萄糖浓度为300、450、600、750、900 g/L的YEPD液体培养基,pH5.0,于28 ℃,150 r/min条件下恒温培养5 d,每12 h取一次样,测定OD600,每个浓度重复3次。

1.3.5.3 低pH耐受性实验 配制pH为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5的YEPD液体培养基,按3%的接种量,分别接种于不同起始pH的YEPD液体培养基,于28 ℃,150 r/min条件下恒温培养5 d,测定OD600,每个pH重复3次。

2 结果与分析

2.1 分离纯化、形态及培养特征观察

从高糖、低pH的发酵液中,筛选具有典型酵母菌菌落特征的菌落,通过形态学观察和显微镜检,分离出Y1、Y2、Y3共3株菌株。3株供试菌在固体、液体培养基上的菌落形态见表1,显微镜检照如图1所示,初步表明该菌株符合酵母菌细胞及形态特征。

图1 供试菌显微镜镜检照(1000×)Fig.1 Tested strains microscope photos(1000×)

2.2 菌株鉴定结果

2.2.1 菌株生理生化特征 3株菌株的生理生化特征见表2。

表2 分离菌株生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of tested strains

注:+:阳性,-:阴性;V可变。

综合上述生理生化实验结果,根据《酵母菌的特征及鉴定手册》,初步判断三株菌株属于接合酵母属。

2.2.2 分子生物学鉴定 利用NL1和NL4一对引物扩增3株供试菌26S rDNA近5′端的D1/D2区域,得到约550～600 bp片段,供试菌的26S rDNA D1/D2区电泳结果见图2。

图2 供试菌的26S rDNA D1/D2区域凝胶电泳图Fig.2 Tested strains’ electrophoretic picture of the aim gene

3株菌序列结果在GenBank数据库进行比对,结果显示,Y1、Y2、Y3三株菌株与鲁氏接合酵母的同源相似性均达到99%以上。同源菌株基因用MEGA6软件处理,得到系统进化树,如图3所示,从图3中可以看出,Y1、Y2、Y3三株菌株与鲁氏接合酵母形成一个分支,验证可信度达到99%,初步确定3株菌株均为鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii,Z.rouxii)。

图3 系统进化树Fig.3 Neighbour-joining tree of the phylogenetic affiliation of the isolated strain

目前,鲁氏接合酵母作为酱油后期发酵风味物质形成的主要菌种之一,在酱油生产中已广泛应用[15]。有研究报道鲁氏接合酵母为嗜高渗酵母[18],在极端的生长条件下可以生长[16-17]。Taing等[18]研究表明耐高糖的鲁氏接合酵母在发酵过程中可以产生谷氨酸、苹果酸和琥珀酸等有机酸,Naylin等[19]用乙酸乙酯提取耐高糖鲁氏接合酵母的培养液,通过测定提取液的多酚含量和抗氧化活性,发现该菌种的代谢物具有抗氧化活性,该菌种可以作为天然抗氧化物的来源。说明研究鲁氏接合酵母在植物酵素中的应用具有重要的意义。

2.3 耐受性考察

选取Y1菌株进行耐受性实验。

2.3.1 生物量-吸光度标准曲线 生物量-吸光度标准曲线见图4,y=3.0493x+0.0136,R2=0.9955,x为生物量(g/L),y为吸光度。

图4 生物量-吸光度标准曲线Fig.4 The standard curve of biomass-abs

2.3.2 高糖耐受性考察 Y1菌株高糖耐受性实验结果显示,在初始葡萄糖含量300～750 g/L时,随着初始葡萄糖含量的增加,菌株生长的延滞期增长,当初始糖浓度为300、450、600、750 g/L时,菌株的延滞期分别为12、12、36、60 h,实验结果见图5。当初始糖浓度为900 g/L时,菌株的延滞期为8 d,且生长极其缓慢。

图5 Y1在不同起始葡萄糖浓度下菌种生长曲线Fig.5 Growth curve of Y1 under different initial glucose concentrations

Rojo等[20]等研究发现,在初始糖浓度为30%～80%条件下,鲁氏接合酵母均可生长;Membré等[21]考察了初始糖浓度在300～900 g/L条件下,菌种的生长速率,发现在高糖环境下,菌种的生长速率很低;王虎玄等[22]从浓缩的苹果汁中筛选出鲁氏接合酵母,研究发现,当糖度为70 °Brix(糖含量约为875 g/L)时,该菌种仍可缓慢生长;说明该菌种可以在高糖环境下生长,与本文研究结果一致。

2.3.3 低pH耐受性考察 Y1菌种低pH耐受性实验结果见图6,随着培养基起始pH的降低,菌种的延滞期增长。当培养基的起始pH为1.5和2.0时,菌种不生长;当培养基的起始pH为2.5、3.0、3.5时,该菌种的延滞期分别为96、48、48 h。

图6 Y1在不同起始pH条件下菌种生长曲线Fig.6 Growth curve of Y1 under different initial pH conditions注:pH1.5和pH2.0条件下的菌种生长曲线重合。

王虎玄等[22]通过考察不同糖度和酸度对鲁氏接合酵母生长的影响,发现糖度对该菌株生长影响较小,pH为2.0时,可以完全抑制该菌株的生长;Rojo等[20]研究了pH(1.7～3.2),糖度(64～68 °Brix)条件下,鲁氏接合酵母的生长特性,研究发现,pH低于2.0,可以有效地抑制该菌株的生长,在高糖环境下,该菌株在pH1.9时可以缓慢生长,当pH为1.7时,该菌株不生长;Vermeulen等[23]研究发现,pH为3.5～7之间时,对鲁氏接合酵母的生长影响不大,只有当pH低于2.5时,才能对菌株的生长起到明显的抑制作用;上述研究结果与本实验从树莓酵素中分离出的菌株的考察结果基本一致。

3 结论

从发酵3年的树莓酵素原液中分离出Y1、Y2、Y3等3株菌株,3株菌种均被鉴定为鲁氏接合酵母;该菌种在初始葡萄糖含量300～900 g/L时,均可生长,随着初始葡萄糖含量的增加,菌种生长的延滞期增长;当培养基初始pH为2.5～3.0时,随着培养基初始pH的降低,菌种的延滞期增长,当培养基初始pH≤2.0时,菌种生长受到抑制。该菌种可在高糖、低pH条件下生长。

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Screening,identification and properties of osmophilic yeast from raspberry Jiaosu during natural fermentation process

WANG Zhen-zhen1,2,3,SHA Ru-yi1,2,3,*,CAI Cheng-gang1,2,3,JIANG Zeng-liang4,
FANG Sheng5,CHENG Yong-jie1,2,3,FAN Fan1,2,3，MAO Jian-wei1,2,3,*

(1.School of Biological and Chemical Engineering,Zhejiang University of Science & Technology,Hangzhou 310023,China; 2.Zhejiang Provincial Key Lab for Chem & Bio Processing Technology of Farm Product,Hangzhou 310023,China; 3.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing,Hangzhou 310023,China; 4.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 5.Shaoxing University Yuanpei College,Shaoxing 312000,China)

In order to get excellent osmophilic yeast strains for the production of microbial fermentation of plant products,three strains from raspberry Jiaosu were isolated and screened. And the morphological,physio-biochemical characteristics as well as 26S rDNA gene sequence analysis were used to identify the strains. The results showed that the morphological features of Y1,Y2 and Y3 were similar to each other,and they could grow at very high sugar concentrations. The sequences of three isolated osmophilic strains showed a high degree(>99%)of homology to those reported in Genbank and they were finally indentificated asZygosaccharomycesrouxii(Z.rouxii). In the study,Z.rouxiicould grow at the initial glucose concentration of 300,450,600 and 750 g/L and the lag phase were 12,12,36 and 60 h,respectively. The strain growed extremely slowly at initial glucose concentration of 900 g/L. When intial pH values were 2.5,3.0 and 3.5,the adapted strain responded with a lag phase of 96,48 and 48 h,respectively,and no growth was abserved at intial pH1.5 and 2.0.Z.rouxiiwasthe dominant yeasts in raspberry Jiaosu,and it was a sugar-tolerant and low pH tolerated yeast.

raspberry Jiaosu;high-sugar-tolerant;tolerating low pH;Zygosaccharomycesrouxii

2016-09-26

王珍珍(1988-),女,硕士研究生,研究方向:生物质资源利用技术与工程,E-mail:cnhkwzz@163.com。

*通讯作者:沙如意(1982-),男,博士,讲师,研究方向:农业生物资源生化制造研究,E-mail:kevinsha_0204@163.com。 毛建卫(1964-),男,硕士,研究方向:农业生物资源生化制造研究,E-mail:zjhzmjw@163.com。

浙江省重点科技攻关项目(2006C12068);浙江省科技计划项目(2016C37078);浙江省大学生新苗计划(2016R428006);浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心开放基金项目(2016KF0040、2016KF0114)。

TS255.44

A

1002-0306(2017)08-0178-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.026