聚类分析和主成分分析法研究甜味绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱

马 赟,王起文,蔡 静,张园娇,纪乐军,陈建伟,*,李 祥

(1.南京中医药大学药学院,江苏南京 210023; 2.江苏神华药业有限公司,江苏淮安 211600)

聚类分析和主成分分析法研究甜味绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱

马 赟1,王起文1,蔡 静1,张园娇1,纪乐军2,陈建伟1,*,李 祥1

(1.南京中医药大学药学院,江苏南京 210023; 2.江苏神华药业有限公司,江苏淮安 211600)

研究了12批5个不同产地的甜味绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱,并进行聚类分析和主成分分析。采用Hedera ODS-2色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)以0.1%磷酸水溶液(A相)-乙腈(B相)为流动相,0.8 mL/min梯度洗脱,建立甜味绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱。结果表明不同产地批次的甜味绞股蓝指纹图谱相似度在0.977～0.996之间,共标定14个共有峰,其中3号峰为芦丁。利用SPSS 22.0软件进行聚类分析和主成分分析,结果表明样品产地可被聚为3大类,两个主成分的累积方差贡献为88.786%。将中药指纹图谱及聚类分析、主成分分析相结合,为甜味绞股蓝的质量评价及资源利用提供基础。

甜味绞股蓝,黄酮类成分,HPLC指纹图谱,芦丁,聚类分析,主成分分析

绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino的全草,主要分布于陕西、山西和长江以南各地[1],是一类“药食同源”类植物资源,应用日趋广泛,如治疗高脂血症的绞股蓝冲剂、抗肿瘤的1023合剂等[2-3],同时还可做成茶剂用于降脂减肥[4]。黄酮类成分是绞股蓝的主要成分之一,具有抗氧化、清除氧自由基、改善心脑血管循环、扩张冠状动脉血管、保护心肌细胞等作用[5-8]。

市售绞股蓝口味差别较大,普遍将绞股蓝按照口感差异分为甜味、苦味、淡味,其中甜味绞股蓝由于其独特的口感广泛用于茶叶、保健品原料[9-10]。目前市场上销售甜味绞股蓝的产地来源较多,质量参差不齐,难以保障相应食品、药品的质量,故建立绞股蓝质量评价体系,以确保其应用显得极为迫切。近年来,HPLC指纹图谱作为一种研究复杂物质体系的技术手段,被广泛应用于质量控制等方面,具有快速准确的特点。虽有文献[11-13]对绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱进行了探索,但均未对绞股蓝的口感进行区分,也未对共有化学特征峰等进行统计学分析,信息非常有限。为更全面地控制绞股蓝的质量,本实验建立了以甜味绞股蓝黄酮类成分为基础的HPLC指纹图谱,测定12个不同产地批号的甜味绞股蓝,以黄酮类成分指纹图谱进行对比分析,并结合聚类分析和主成分分析,对其模式进行识别研究,为含甜味绞股蓝类保健食品、药品原料的优选提供一定的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜味绞股蓝 共12批次,样品信息见表1,经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为葫芦科植物绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino;芦丁对照品 中国食品药品检定研究院,批号100080-201409;乙腈 色谱纯,德国Merck公司;水 超纯水;其他试剂 均为分析纯。

2695型高效液相色谱仪 包括2489型PDA二极管阵列检测器,Empower工作站,美国Waters公司;BT125D型电子天平 德国Sartorius公司;KQ-2200B超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司;超纯水仪 美国Millipore公司;Allegra X-30R离心机 美国贝克曼公司。

表1 样品信息Table 1 Information of sweet Gynostemma pentaphyllum samples

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 取芦丁适量,精密称定,加甲醇溶解制成含芦丁2.74 mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 取绞股蓝样品粉末(过4号筛)约0.5 g,置于50 mL离心管中,加甲醇20 mL,超声(500 W,40 kHz)处理1 h,离心(5000 r/m)10 min,取上清液转移至25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。用0.45 μm微孔滤膜过滤,即得[14]。

1.2.3 色谱条件 采用Hedera ODS-2(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,流动相:0.1%磷酸水溶液(A相)-乙腈(B相),梯度洗脱(0～15 min,90%～85% A;15～25 min,85%～80% A;25～30 min,80%～70% A;30～40 min,70%～50% A;40～60 min,50%～0% A;60～80 min,0% A);体积流量:0.8 mL/min;检测波长:370 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度实验 取同一供试品溶液,连续进样6次,所得谱图采用指纹图谱软件的相似度系统分析。

1.2.4.2 稳定性实验 取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、12、24 h进样,每次进样定量为10 μL,所得谱图采用指纹图谱软件的相似度系统分析。

1.2.4.3 重复性实验 取同一供试品,平行制备6份并检测,所得谱图采用指纹图谱软件的相似度系统分析。

1.2.5 甜味绞股蓝黄酮类成分的测定 分别将芦丁对照品溶液和各批次供试品溶液注入高效液相色谱仪中,在“1.2.3”项色谱条件下进行测定,记录色谱图。

1.3 指纹图谱的建立与技术参数的设定

将甜味绞股蓝的色谱数据以AIA(*cdf)格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版),设定样品参照图谱,对色谱图进行多点校正,自动匹配,时间宽度为0.1 min,经系统自动匹配,生成对照指纹图谱R,并建立12批次甜味绞股蓝黄酮类成分的指纹图谱。

1.4 数据分析

采用SPSS 22.0软件以不同产地批次甜味绞股蓝的共有峰峰面积为原始数据,采用组间平均数联结,以夹角余弦为样品相似度的距离公式,进行系统聚类分析。采用SPSS 22.0软件对原始数据进行标准化处理,以主成分的特征值及贡献率为依据,对不同产地批次甜味绞股蓝的共有峰(变量)进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

精密度实验所得谱图相似度均≥0.999,稳定性实验所得谱图相似度均≥0.999,重复性实验所得谱图相似度均≥0.992,表明仪器精密度较好,供试品溶液在24 h内稳定,实验方法重复性高,均符合指纹图谱的要求。

2.2 甜味绞股蓝黄酮类成分的HPLC指纹图谱

通过进样芦丁对照品溶液和各批次供试品溶液,结果显示芦丁在各产地样品图谱中均有出现,芦丁对照品溶液及其中一个批次甜味绞股蓝供试品溶液(S2)的液相色谱图见图1,12批供试品色谱图共有成分峰匹配结果及生成的对照指纹图谱R见图2。从图2中可以看出12批次样品的出峰数目、分离度均较理想。各共有峰较稳定,具有指纹图谱特征。

2.3 指纹图谱共有峰的标定

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统的数据匹配功能,在对照指纹图谱上共标定14个共有指纹峰,见图3。其中3号峰为芦丁,且3号峰分离度良好,保留时间适宜,故选为参照峰。各产地批次甜味绞股蓝的共有峰保留时间与峰面积见表2。由表2可看出,各产地批次甜味绞股蓝的共有峰在同一保留时间处有不同的峰面积,可能受生长环境、种质资源、经纬度等各因素的影响,导致其质量存在差异。

表2 共有峰的相对峰面积Table 2 Relative peak areas of common peaks

图2 12批甜味绞股蓝黄酮类成分匹配色谱图Fig.2 The matched chromatograms of flavonoids in 12 batches of sweet Gynostemma pentaphyllum

图3 对照指纹图谱RFig.3 The reference fingerprint chromatogram of sweet Gynostemma pentaphyllum

2.4 相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统,计算12批绞股蓝HPLC指纹图谱的相似度,以生成的共有模式为对照,相似度在0.977～0.996之间,见表3,表明各产地甜味绞股蓝均有良好的相似性。

由于相似度计算无法准确鉴定甜味绞股蓝的产地来源,同时考虑各共有峰之间的差异,本实验再通过聚类分析和主成分进行统计学分析。

2.5 聚类分析

不同产地甜味绞股蓝的14个共有峰峰面积为原始数据进行系统聚类分析的结果见图4。由图4可知,绞股蓝样品被分为3大类,Ⅰ类包括S6、S7、S11、S4、S10;Ⅱ类包括S1、S2、S9、S3、S5、S12;Ⅲ类包括S8。

表3 12批甜味绞股蓝HPLC指纹图谱相似度评价Table 3 Evaluation of similarity degree of 12 batches of sweet Gynostemma pentaphyllum

图4 聚类分析树状图Fig.4 Dendrogram of cluster analysis

其中,广西、湖北、江苏产地的甜味绞股蓝聚在一起,说明这3个产地甜味绞股蓝生长环境相当,同时其指纹图谱相似度接近。而且,它与相似度分析结果较为一致,得到了相互验证。

2.6 主成分分析

12个不同产地批次甜味绞股蓝的14个共有峰(变量)进行主成分分析的结果见表4。利用主成分分析,得到了2个主成分,累计方差贡献率为88.786%,说明这2个主成分可表达全部甜味绞股蓝黄酮类成分的88.786%,只有11.214%的信息丢失。其中,第一主成分方差贡献率最大,贡献率为72.741%,是甜味绞股蓝最重要的黄酮类成分群,它所包含的化学成分基本反映出各产地黄酮类成分之间的相似性。

旋转后的公共因子载荷矩阵见表5,可知每个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数。2个主成分与14个共有峰指标的线性组合模型如下,计算综合得分。以第一、第二主成分为变量,得到二维投影图,见图5。以X轴为例,在投影图中选取距离原点较远的几个点,得到第一主成分中变量的权重值,权重值越大,该化合物在绞股蓝中的作用越大。其中,前6名变量的权重值分别为0.943、0.942、0.879、0.865、0.815、0.803,对应p9、p5、p1、p2、p4和p6号峰。从对照品色谱图可知,此6个峰为未知成分,需结合质谱等手段作进一步确定。

表5 旋转后的公共因子载荷矩阵表Table 5 Load matrixes of postrotational common factors

注:p为“peak”缩写,代表色谱峰。

图5 HPLC指纹图谱的二维投影图Fig.5 2D projection map of HPLC fingerprint

3 结论

建立全面、系统、特征性的指纹图谱,是评价绞股蓝质量的有效办法,本实验建立12个不同产地批次甜味绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱,标定14个共有峰,以共有模式为对照,进行相似度评价,表明所含化学成分基本相同,但也存在一定的差异,而究其内在原因,推测甜味绞股蓝黄酮类成分的差异与产地生态环境、采集加工方法等因素有关[15-16]。以此为数据基础,通过聚类分析和主成分分析,以甜味绞股蓝产地为区分指标,可以有效评价甜味绞股蓝的区域差异性,筛选出共有的特征成分,引导发现决定性作用的化学成分,从而为其质量评价及资源利用提供数据基础。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草[M]. 第13卷. 上海：上海科学技术出版社,1999:532.

[2]陈耀璋,钟义祥,陈明全,等. 股蓝参冲剂制备方法的实验研究[J].中药材,1994,17(3):37-38.

[3]陈作良,官玉芹,李辉,等. 1023合剂对实验性口腔癌的抑瘤及阻癌的正交实验研究[J]. 中华口腔医学杂志,1998,33(1):50-52.

[4]夏菊兰. 减肥降脂茶[J]. 东方药膳,2007(10):32-33.

[5]颜燕,郭婕,杨非,等. 绞股蓝、山楂提取物对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠抗氧化作用的实验研究[J]. 实验动物科学,2009,26(3):24-26.

[6]李乐,高小利,丁宝兴,等. 绞股蓝总黄酮对缺氧/复氧心肌细胞TNF-α浓度,Fas/FasL蛋白表达的影响[J].中国中药杂志,2007,32(18):1925-1927.

[7]李乐,孙晓东,高小利,等. 绞股蓝总黄酮对犬急性缺血心肌的保护作用[J]. 中国病理生理杂志,2008,24(2):388-

389,392.

[8]孟娜,魏胜华,陶玉贵,等. 超声波-酶法联合提取绞股蓝总黄酮及其抗氧化活性的研究[J]. 食品工业科技,2014,35(3):138-141.

[9]王祖学,彭德太. 冲绳“201”甜味绞股蓝的引种生产及研制加工[J]. 时珍国医国药,1994,5(1):33-35.

[10]张涛,张育松. 福建甜味绞股蓝茶的保健成分及其市场现状和展望[J]. 亚热带农业研究,2008,4(2):154-157.

[11]刘芳,胡坪,任德全,等. 绞股蓝药材黄酮类化合物的HPLC指纹图谱研究[J]. 中成药,2009,31(4):493-495.

[12]卢金清,陈黎,肖波,等. 绞股蓝药材黄酮类成分HPLC指纹图谱研究[J]. 中药材,2007,30(8):929-932.

[13]彭亮,李诒光,陈杰,等. 绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱快速分析[J]. 中国实验方剂学杂志,2016,11(1):53-56.

[14]中华人民共和国香港特别行政区卫生署,香港中药材标准[S]. 五期. 香港:2013:162-172.

[15]彭亮,李诒光,陈杰,等. 不同产地、不同品种绞股蓝总黄酮含量比较研究[J]. 亚太传统医药,2015,11(21):33-35.

[16]李馨芸,刘世彪,易浪波,等. 绞股蓝属3种植物的总皂苷、总黄酮和矿质元素含量的季节性变化[J]. 中药材,2012,35(1):26-30.

HPLC fingerprint of flavonoids in sweetGynostemmapentaphyllum
by cluster analysis and principal component analysis

MA Yun1,WANG Qi-wen1,CAI Jing1,ZHANG Yuan-jiao1,JI Le-jun2,CHEN Jian-wei1,*,LI Xiang1

(1.College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China; 2.Jiangsu Shenhua Pharmaceutical Co.,Ltd.,Huaian 211600,China)

To establish the HPLC fingerprint of flavonoids in 12 batches of sweetGynostemmapentaphyllumfrom five different growing areas and to make cluster analysis and principal component analysis.The analysis was performed on Hedera ODS-2 column,mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution,flow rate was 0.8 mL/min,column temperature was maintained at 30 ℃,and detection wavelength was set at 370 nm.Results showed that different origins fingerprints similarity were between 0.977 and 0.996.There were fourteen common peaks in the HPLC fingerprints,one of which was identified as Rutin.SweetGynostemmapentaphyllumwas identified with the models of principal component analysis and cluster analysis carried out by SPSS 22.0. The growing areas of samples can be classified into three groups,and two principal components make up 88.786% of the total variance.The Chinese materia medica fingerprint is combined with cluster analysis and principal component analysis to provide basis for the quality evaluation and resource utilization ofGynostemmapentaphyllum.

sweetGynostemmapentaphyllum;flavonoids;HPLC fingerprint;rutin;cluster analysis;principal component analysis

2016-09-26

马赟(1987-)，女，在读硕士研究生，研究方向：中药品质评价，E-mail:myunok@163.com。

*通讯作者:陈建伟(1955-)，男，教授，主要从事中药品质评价与中药生物技术方面的研究，E-mail:chenjw695@126.com。

江苏省科技成果转化项目(BA2014118)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)08-0063-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.004