AEG—1、P16、KI—67蛋白在宫颈癌前病变中的表达与临床意义

赵娟　马唯　吴林林　陈隈陟　刘凤阁

[摘要]目的：探讨AEG-1、P16、KT-67蛋白在宫颈癌前病变中的表达与临床意义。方法：2008年2月至2015年9月选择在我院诊治的宫颈癌前病变患者98例作为癌前病变组，同期选择宫颈癌患者98例作为宫颈癌组和98例健康体检人作为对照组，取三组的宫颈样本都进行AEG-1、P16、KT-67蛋白表达的免疫组化分析，并调查了临床资料进行相关性分析。结果：AEG-1、P16、KT-67蛋白在宫颈癌组的阳性表达率分别为80.0%、93.9%和92.9%，而癌前病变组为57.1%、50.0%和57.1%，在对照组为3.1%、2.0%和4.1%，三组间对比差异有统计学意义（P<0.05）。AEG-1、P16、KT-67蛋白的阳性表达与宫颈癌前病变的年龄、疾病类型、HPV感染等病理参数对比差异有统计学意义（P<0.05）。直线相关性显示AEG-1、P16、KT-67蛋白表达都呈现两两正向相关性（P<0.05）。结论：AEG-1、P16、KT-67蛋白在宫颈癌前病变中都呈现高表达状况，且与临床病理特征存在相关性，三者可互相作用影响宫颈癌前病变的发展状况。

[关键词]AEG-1；P16；KI-67；宫颈癌前病变；相关性

宫颈癌是女性最为常见恶性肿瘤之一，我国当前宫颈癌的发生率逐渐增高，且呈现年轻化趋势。宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）为常见的宫颈癌前病变，不过发展为宫颈癌的时间比较长，一般在15年左右，在这个时间段可以对宫颈上皮内瘤变进行有效诊断，从而预防宫颈癌的发生。星型胶质细胞上调基因-1（Astrocyte elevated gene-1，AEG-1）与肿瘤的侵袭转移，血管生成及化疗耐药密切相关，可能是多种肿瘤的一个重要的潜在预后指标。原发肿瘤因子-16（premature tumor-16，P16）基因为一种细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂，可直接参与细胞周期调控，在宫颈癌及癌前病变中p16基因主要表现为过表达。细胞增殖核抗原一67（nuclcar-associated antigen KT-67）可能是為DNA复制提供场所的核基质及染色体支架的一种组分，可以用来识别生长期的正常细胞和肿瘤细胞，可参不驱动细胞周期的调控网络。肿瘤恶性程度越高，KT-67蛋白表达水平越高，肿瘤细胞增殖越快。本文具体探讨了AEG-1、P16、KT-67蛋白在宫颈癌前病变中的表达与临床意义，现报道如下。

1.资料与方法

1.1研究对象

2008年2月至2015年9月选择在我院诊治的宫颈癌前病变患者98例作为癌前病变组，同期选择宫颈癌患者98例作为宫颈癌组和98例健康体检人作为对照组，纳入标准：年龄20～70岁；癌前病变与宫颈癌都得到病理证实；均未行放疗、化疗及免疫治疗；知情同意本研究且得到医院伦理委员会的批准。排除标准：有免疫缺陷疾病；既往有宫颈病变史。癌前病变组中年龄最小35岁，最大68岁，平均年龄（61.34±4.52）岁；平均体重指数为（21.47±2.44）kg/m2；疾病类型：CIN I型40例，CINⅡ型40例，CINⅢ型18例。宫颈癌组中年龄最小42岁，最大69岁，平均年龄（60.67±3.18）岁；平均体重指数（21.22±3.19）kg/m2；病理类型：鳞癌58例，腺癌40例；临床分期：Ⅰ期44例，Ⅱ期30例，Ⅲ期24例。而对照组中年龄最小22岁，最大68岁，平均年龄（45.67±4.19）岁；平均体重指数为（21.89±2.22）kg/m2。

1.2免疫组化方法

鼠抗人AEG-1单克隆抗体（即用型抗体，批号TA803710）购自R&D公司，鼠抗人P16单克隆抗体（即用型抗体，批号ZM-0205）购自博士得生物有限公司，鼠抗人KT-67单克隆抗体（即用型抗体，批号ST-0910）购自福建迈新生物技术有限公司。

DAB显色试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司（生产批号为20942244），免疫组化染色试剂盒购自于北京中杉金桥生物技术有限公司（生产批号为20134461）。采用Envision二步法检测AEG-1、P16、KT-67蛋白的表达情况，在免疫组化过程中，选择经HE染色证实的宫颈组织石蜡块，3um石蜡切片，放置于载玻片，60℃烤片4h；切片经二甲苯脱蜡2次，依次梯度酒精后充分水洗；进行微波处理修复抗原，蒸馏水冲洗，5min×3次；滴加50uL 3%H2O2溶液处理15min，以阻断内源性迪氧化物酶，PBS冲洗，5min×3次；滴加50uL第一抗体（AEG-1、P16、KT-67）工作液，4℃孵育12h，PBS冲洗，5min×3次；滴加50txL第二抗体工作液，25℃孵育30min，PBS冲洗，5min×3次；DAB（3，3-二氨基联苯胺Tris缓冲液）室温下3～5min显色，自来水冲洗终止显色；苏木素复染细胞核1～2min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片、显微镜下观察。以已知的阳性对照染色片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。

1.3观察指标

以细胞核内呈现棕黄色颗粒为阳性，每张切片在400倍光学显微镜计数癌细胞，阳性率≥20%定为阳性，每张切片由两位病理专家独立阅片共同协商出判断结果。

1.4统计方法

选择SPSS17.00软件进行分析，而计数数据对比采用卡方分析；计量数据选择（x±s）表示，对比采用单因素方差分析或者t检验；相关性分析采用直线相关分析，P<0.05认为有统计学意义。

2.结果

2.1AEG-1、P16、KT-67蛋白的表达情况对比

AEG-1、P16、KT-67蛋白在宫颈癌组中主要在细胞的核周和细胞质中表达，在癌前病变组主要表达在异型细胞的核周和细胞质。见图1、图2、图3。经过判定，AEG-1、P16、KT-67蛋白在宫颈癌组的阳性表达率分别为80.0%、93.9%和92.9%，而癌前病变组为57.1%、50.0%和57.1%，在对照组为3.1%、2.0%和4.1%，三组间对比差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2AEG-1、P16、KT-67蛋白表达与宫颈癌前病变病理参数的相关性

经过资料调查与对比分析，AEG-1、P16、KT-67蛋白的阳性表达与宫颈癌前病变的年龄、疾病类型、HPV感染等病理参数对比差异有统计学意义（P<0.05），表现为年龄越大，CINⅢ型和HPV感染的AEG-1、P16、KT-67蛋白阳性表达率都比较高。见表2。

2.3AEG-1、P16、KT-67蛋白在癌前病变中表达的相关性

直线相关性显示，AEG-1、P16、KT-67蛋白表达都呈现两两正向相关性（P<0.05）。见表3。

3.讨论

宫颈癌是最常见妇科恶性肿瘤之一，其中多数为鳞状细胞癌与腺癌，一般认为宫颈癌的发生与性生活过早、多产、多个性伴侣及HPV感染等因素有关。不过宫颈癌的发病过程持续比较久，长期的慢性子宫颈炎-子宫颈上皮内瘤发-原位癌-浸润癌是一个逐渐发展的过程，特别是癌前病变按照异型增殖细胞累及宫颈黏膜上皮的层次，分为CIN Ⅰ、CINⅡ、CINⅢ，针对癌前病变进行分析，有利于预防与控制宫颈癌的发生。

AEG-1最先发现在胶质母细胞瘤中，随后的研究发现AEG-1在腺癌、食管鳞癌、原发性肝细胞癌等多种肿瘤中异常表达，并与肿瘤的发生发展和预后密切相关。有学者采用多组织核酸印迹法证实AEG-1的mRNA在脊椎动物的脑、肾、膀胱、前列腺、胸腺、心脏、肝、脾、肺等组织器官中均有不同水平的表达。P16基因是直接参与细胞周期调控的抑癌基因，P16基因失活可使得宫颈上皮细胞的细胞周期发生紊乱，从而启动一系列癌变过程。KT-67蛋白被公认为是能准确可靠反映细胞群增殖活性的客观指标。本研究显示AEG-1、P16、KT-67蛋白在宫颈癌组的阳性表达率分别为80.0%、93.9%和92.9%，而癌前病变组为57.1%、50.0%和57.1%，在对照组为3.1%、2.0%和4.1%，三组间对比差异有统计学意义（P<0.05），表明AEG-1、P16、KT-67蛋白都在宫颈癌前病变中呈现高表达状况。

AEG-1是一个敏感的诊断癌前病变的指标，有研究发现AEG-1在正常宫颈上皮组织、癌前病变组织和宫颈癌组织中的过表达率是逐步升高的，且AEG-1蛋白在宫颈癌中多为强阳性表达，并发现其升高程度与患者的预后成正相关。有研究发现胃癌患者AEG-1高表达组的中位生存时间明显低于AEG-1低表达组，AEG-1表达水平与胃癌的预后密切相关。而HPV感染后，病毒进入宿主细胞进行整合需要E1和E2蛋白的缺失，二者的缺失可导致癌蛋白水平升高，也引起细胞内pRb蛋白功能失調，诱导P16蛋白过表达。而Ki-67表达不只限于基底层细胞，阳性细胞比例增加，与宫颈癌的发生、发展及恶性程度有关。本研究显示AEG-1、P16、KT-67蛋白的阳性表达与宫颈癌前病变的年龄、疾病类型、HPV感染等病理参数对比差异有统计学意义（P<0.05），说明AEG-1、P16、KT-67蛋白可能参与宫颈癌的恶性表型的进展过程。

细胞增殖是机体的基本生物学特征，当发生致癌因素时，细胞增殖失控和分化受阻，导致肿瘤的发生。本研究直线相关性显示AEG-1、P16、KT-67蛋白表达都呈现两两正向相关性（P<0.05），其中P16蛋白的过表达与HPV感染有关；而Ki-67表达与CIN级别显著相关，且不同Ki-67阳性表达级别组的HR-HPV负荷有显著差异；AEG-1蛋白的阳性过表达率与宫颈癌的组织学分级、淋巴结转移、临床分期、肌层浸润深度之间密切相关。

总之，AEG-1、P16、KT-67蛋白在宫颈癌前病变中都呈现高表达状况，且与临床病理特征存在相关性，三者可互相作用影响宫颈癌前病变的发展状况。