畲药“十二时辰”水煎剂的急性毒性实验研究

张继州+周春权+李细彬+雷华杰+韩静+贺肇东+胡娟

【摘要】目的：研究畲药“十二时辰”水煎剂对小鼠的急性毒性，以初步评价其安全性。方法：以不同剂量“十二时辰”水煎剂对小鼠灌胃，观察毒性症状，记录死亡情况，并计算最大耐受量（MTD）、最小致死量（MLD）及半数致死量（LD50）的值。结果：小鼠口服“十二时辰”水煎剂的最大耐受量（MTD）为2744g/kg，最小致死量（MLD）为392g/kg，半数致死量（LD50）为6008g/kg。结论：“十二时辰”临床应用时，需严格控制口服剂量。

【关键词】十二时辰；急性毒性；最大耐受量；最小致死量；半数致死量

【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）08-0027-03

“十二时辰”为毛茛科植物重瓣铁线莲Clematis florida Thunb var.plena DDon的干燥根[1]，为福建福安畲医习用药。《福安畲医畲药》记载，其性温、味辛，具有通经活络、通关窍、怯风除湿、活血止痛、理气通便、利尿、解毒等功效，主治跌打损伤，关节肿痛，虫蛇咬伤[2]；《中华本草》记载其“味苦、微辛； 性温，小毒，归肝、脾、肾经，可利尿、通络、理气通便、解毒”，主治风湿性关节炎、小便不利、闭经、便秘腹胀、风火牙痛、眼起星翳、虫蛇咬伤、黄疸等[3]，是一味地方特色鲜明的民族药，值得进一步研究并加以开发应用。关于十二时辰的化学成分，近年已有相关报道[4-5]，其主要活性成分包括棕榈酸及其甲酯、乙酯以及齐墩果酸等。但迄今为止，对于“十二时辰”及其原植物重瓣铁线莲的安全性评价还未见文献报道。研究通过小鼠口服不同剂量“十二时辰”水煎剂，观察毒性症状，记录死亡情况，并计算最大耐受量（MTD）、最小致死量（MLD）及半数致死量（LD50）的值，为其临床安全使用奠定基础。

1仪器与材料

11仪器与试药YP502N电子天平（上海精密科学有限公司）、WK2102电磁炉（美的），“十二时辰”生药（批号：20160501）购买自福建福安。

12实验动物清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～22g，购自上海斯莱克实验动物中心（合格证号：SCXK（沪）2012-0002），光暗周期12/12 h（光照时间8∶00～20∶00）下饲养，自由饮食，室温保持 18～22℃，相对湿度 40%～70% ，实验前适应性喂养3d。

2方法

21水煎剂制备用电子天平称取“十二时辰”药材400g，加水12倍体积煎煮1h，再先后加水10倍体积和8倍体积各煎煮05h，合并三次煎煮液，浓缩至200mL，即得2g/mL浓缩液备用，用时再用蒸馏水配成相应浓度。

22最大耐受量和最小致死量的测定预试验中，80g/kg剂量的“十二时辰”水煎剂灌胃造成小鼠全部死亡，而8g/kg及08g/kg两剂量无死亡。因此正式试验中，在80g/kg和8g/kg剂量之间，以070等比组距，设置5个剂量组，其剂量分别为56g/kg、392g/kg 、2744g/kg、192g/kg、1344g/kg。

实验动物随机分为5个实验组及1个空白对照组，每组10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水16h。各实验组按04mL/10g体重灌胃给予上述剂量“十二时辰”水煎剂，空白对照组给予等体积的蒸馏水，观察其毒性症状，记录死亡情况，确定小鼠口服“十二时辰”水煎剂的最大耐受量（MTD）和最小致死量（MLD）。

23LD50的测定参考22结果，经预试验，得出小鼠口服“十二时辰”水煎剂的100%致死量（Dm）为64 g/kg，0%致死量（Dn）为328g/kg，两者之比接近2倍。故根据改良寇氏法（Krber氏法）[6]，参考Dm和Dn，以085等比组距，设置6个剂量组，其剂量分别为753g/kg、64g/kg、544g/kg、462g/kg、393g/kg、334g/kg。

实验动物随机分为6个实验组及1个空白对照组，每组10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水16小時。各实验组按04mL/10g体重灌胃给予上述剂量“十二时辰”水煎剂，空白对照组给予等体积的蒸馏水，观察其毒性症状，记录死亡情况，并计算小鼠口服“十二时辰”水煎剂的半数致死量（LD50）。

24统计描述及LD50计算方法实验数据以各实验组动物死亡率表示，LD50采用改良寇氏法计算，计算公式如下：

LD50=log-1{Xm-i[∑p-（3-pm-pn）/4]}

其中：Xm为最大剂量组剂量的对数；i为相邻两组高剂量与低剂量之比的对数；p为各组动物的死亡率；∑p为各组p值之和；pm为最高剂量组死亡率；pn为最低剂量组死亡率。

LD50的95%可信区间计算公式如下：

LD50的95%可信区间=LD50±45LD50·i∑p-∑p21n-1

其中：i为相邻两组高剂量与低剂量之比的对数；p为各组动物的死亡率；n为每组的动物数量。

3结果

31一般情况观察空白对照组小鼠精神良好，活动正常，无死亡。“十二时辰”水煎剂组随剂量升高，有静伏不动、活动减少，死亡前抽搐等毒性现象。

32最大耐受量和最小致死量的测定由表1可知，小鼠口服“十二时辰”水煎剂的最大耐受量（MTD）为2744 g/kg，最小致死量（MLD）为392g/kg。

33“十二时辰”水煎剂的LD50的测定各组死亡情况见表2根据改良寇氏法，将表2数据代入计算公式得：LD50=6008 g/kg；LD50的95%可信区间为5442～6573g/kg。

4讨论

急性毒性试验是药物安全性评价的第一步，为后续的长期毒性试验、特殊毒性试验及药效学、药理学研究中剂量选择和指标设计提供重要的参考依据，同时也为临床安全应用奠定基础。

半数致死量LD50是药物的重要特征性参数，准确测定LD50是合理用药、安全用药的重要前提[6]。本次试验满足三个条件：①反应量大致呈正态分布；②给药浓度按照等比级数排列；③各组动物数相等，故采用改良寇氏法（Krber 氏法）作为LD50的计算方法。然而单纯依靠LD50作为急性毒性指标具有一定的缺陷，例如，无法反映不引发动物死亡的剂量与引发动物死亡的剂量之间的范围。因此，配合最大耐受量（MTD）及最小致死量（MLD）等相关数据，可以反映药物毒作用带的宽度，更全面地表示药物的毒性。研究中，小鼠口服“十二时辰”水煎剂的最大耐受量（MTD）为2744 g/kg，最小致死量（MLD）为392g/kg，半数致死量（LD50）为6008 g/kg，其95%可信区间为5442～6573g/kg。按照药理实验中动物間和动物与人体间的等效剂量换算，半数致死量（LD50）的值相当于60kg体重成人服用2920g生药[7]，根据化学物质的急性毒性分级标准，该药材属低毒药材。LD50约为MLD的两倍，说明口服“十二时辰”水煎剂后，自出现小鼠死亡的最低剂量至半数小鼠死亡的剂量存在一定距离，毒剂量带有一定的宽度。此外，小鼠口服“十二时辰”后的毒性现象可知，在致死剂量下其毒作用较为明显，但具体的机制以及靶器官尚需要进一步实验研究加以确认，并与同为铁线莲属的其他药用植物加以对比。

参考文献

[1]黄泽豪，张月玲. 畲药十二时辰的本草考证[J]. 中国民族民间医药，2014，23（1）：2-3.

[2]钟隐芳.福安畲医畲药[M].福州：海风出版社，2010：109-110.

[3]《中华本草》编委会. 中华本草（第三辑） [M]. 上海：上海科学技术出版社，1999：198.

[4]黄泽豪，郭家欣，沈贤娟. 畲药十二时辰挥发油的GC-MS分析[J]. 福建中医药，2014，45（1）：52-53.

[5]刘知远，沈廷明，李细彬，等. HPLC 法测定畲药十二时辰中活性成分齐墩果酸的含量[J]. 中国药师，2016，19（9）：1758-1760.

[6]周立国. 药物毒理学[M]. 北京：中国医药科技出版社，2009：141-142，131-132.

[7]黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J]. 中国临床药理学与治疗学，2004，9 （9）：1069.

（收稿日期2017-02-17：编辑：梁志庆）