药用植物中鲨烯环氧酶的生物信息学分析

赵志新，王凡

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

三萜皂苷（Triterpenoid saponins）作为一类重要的药用植物次生代谢产物，具有保护肝脏、抗凝血、消炎抗病毒、降低胆固醇等多方面的药理作用[1]。三萜类化合物在自然分布很广，在菌类、蕨类植物、单子叶植物和双子叶植物、动物和海洋生物中都有存在，尤其是在双子叶植物中分布最为广泛，主要分布于菊科、石竹科、五加科、豆科、远志科、桔梗科及玄参科[2-4]，特别是普遍存在于绞股蓝、人参、三七、柴胡以及积雪草等多种药用植物中[5]。鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase,SE）也被称为角鲨烯单加氧酶，在细胞内质网中催化鲨烯（角鲨烯）为环氧鲨烯[6]。在植物中，SE催化鲨烯氧化生成2,3-氧化鲨烯，因此被认为是三萜皂苷类化合物合成中一个公认的关键限速酶[7]。同时研究发现，牛樟芝三萜途径中最后一步关键的限速酶也是鲨烯环氧酶（SE）[8]。人参植物中至少含有2种角鲨烯环氧化物酶，一种参与三萜皂苷的合成，另一种可能参与了植物甾醇的合成[9]。本文主要是利用生物信息学的手段，查找已经公布的药用植物中的SE基因的序列数据，并经过整理、分析，根据得到的结果来预测他们之间的同源性和进化关系，为下一步通过分子生物学技术进行基因功能分析及代谢通路研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

检索已发表有关SE研究的学术论文，然后从NCBI查找已公布的相关基因序列。

1.2 方法

运用BLASTn 2.6.0对药用植物中SE核酸序列的同源性进行分析；借助MEGA6.0构建系统发育进化树，分析药用植物中SE基因的进化关系。

2 结果与分析

2.1 不同药用植物SE核酸序列

截止2017年3月10日为止，从NCBI数据库中下载已经公布的药用植物SE的核酸序列，共28条，包括拟南芥，刺五加，枇杷等10种药用植物的核酸序列（见表1）。

表1 不同植物SE核酸序列来源

2.2 核酸序列的比对分析

将收集到的28条SE序列与拟南芥和丹参基因组做BLAST分析。使用BLASTn 2.6.0分别分析拟南芥和丹参基因组数据中的潜在SE序列，选择相似性较高的序列。获得结果如图1～图3。结果显示：拟南芥潜在的SE基因序列与刺五加actinSE基因序列相似性最高。同源性分别是刺五加actin（丹参）82%，枇杷SE2（拟南芥）75%，刺五加actin3（拟南芥）86%，刺五加actin2（拟南芥）83%，刺五加actin1（拟南芥）86%。（括号里的物种名为做BLAST的参照基因组）

图1 丹参基因组与SE序列BLAST图 [刺五加actin(丹参）]

图2 拟南芥基因组与SE序列BLAST图[刺五加actin(拟南芥）]

图3 拟南芥基因组与SE序列BLAST图 [枇杷SE2(拟南芥）]

2.3 构建系统进化树

为了对药用植物中三萜皂苷的代谢通路做更深层次的分析，将所获的NCBI数据库中已经注册的SE核酸序列，经同源性分析后做系统进化分析。将BLASTn搜索得到同源性较高的核酸序列，使用MEGA6.0软件构建系统进化树，依据五种不同算法所构建的进化树，如图4～图8。

2.3.1 Maximum Likelihood Tree算法

由图4可知，从进化树图上来分析，5种SE序列聚成两大支，刺五加actin1,3（拟南芥）和枇杷（拟南芥）聚为一大支；刺五加actin（丹参）和刺五加actin2（拟南芥）聚集为一支；刺五加actin2（拟南芥）和刺五加actin1,3（拟南芥）的亲缘关系较远与枇杷（拟南芥）亲缘关系较近。

2.3.2 Neighbor-joining Tree算法

图4 Maximum Likelihood算法

图5 Neighbor-joining算法

由图5可知，5条SE核酸序列系统进化分析结果表明，5种SE序列聚成三大支，刺五加actin1,3（拟南芥）聚为一大支；枇杷（拟南芥）独立聚为一支；刺五加actin（丹参）和刺五加actin2（拟南芥）为一支；枇杷（拟南芥）与刺五加actin（拟南芥）和刺五加actin(丹参)的亲缘关系较远。其中，刺五加actin与丹参和拟南芥SE亲缘关系较近，但刺五加actin（拟南芥）之间的亲缘关系较远。

2.3.3 Maximum Parsimony Tree算法

由图6可知，5条SE核酸序列系统进化分析结果表明，5种SE序列聚成两大支，刺五加 actin1,2,3（拟南芥）和刺五加 actin（丹参）聚为一大支；枇杷（拟南芥）独立聚为一支；刺五加actin1,2,3(拟南芥)和刺五加actin（丹参）亲缘关系较近，而枇杷（拟南芥）的亲缘关系较远。

图6 Maximum Parsimony算法

2.3.4 UPGMA Tree算法

由图7可知，5条SE核酸序列系统进化分析结果表明，5种SE序列聚成三大支，刺五加actin1,3（拟南芥）聚为一大支；枇杷（拟南芥）独立聚为一支；刺五加actin（丹参）和刺五加actin2（拟南芥）为一支；枇杷（拟南芥）与刺五加actin（拟南芥）和刺五加actin（丹参）的亲缘关系较远。其中，刺五加actin与丹参和拟南芥SE亲缘关系较近，但刺五加actin（拟南芥）之间的亲缘关系较远。

2.3.5 Maximum Parsimony Tree算法

由图8可知，5条SE核酸序列系统进化分析结果表明，5种SE序列聚成两大支，刺五加actin1,3(拟南芥)和枇杷（拟南芥）聚为一大支；刺五加actin与丹参和拟南芥SE为一支；刺五加actin与丹参和拟南芥SE与刺五加actin1,3(拟南芥)的亲缘关系较远，而与枇杷（拟南芥）亲缘关系较近。

图7 UPGMA算法

图8 Maximum Parsimony算法

3 讨论与结论

将获得的SE的核酸序列提交到美国国立生物技术信息中心（NCBI）的核酸序数据库进行BLASTn相似性序列，结果显示：拟南芥SE基因序列与刺五加actinSE基因序列相似性最高。为了分析SE的进化情况，从NCBI的数据库中选取与SE基因编码相似性较高的5条序列（丹参-刺五加actin（HM051058.1），拟南芥-枇杷SE2（NC_003071.7），拟南芥-刺五加 actin3（NC_003074.8），拟南芥-刺五加actin2（NC_003070.9），拟南芥-刺 五 加 actin1（NC_003076.8）），同源性分别达到刺五加actin（丹参）82%，枇杷SE2（拟南芥）75%，刺五加actin3（拟南芥）86%，刺五加actin2（拟南芥）83%，刺五加actin1（拟南芥）86%。从系统进化树可以看出，刺五加actinSE基因与拟南芥SE基因的亲缘关系较近，这与序列BLASTN的分析结果一致。系统进化分析将包括人参在内的24种植物的SE进行比较分析，从结果中可以得出，刺五加actin1,2,3（拟南芥）和刺五加actin（丹参）亲缘关系较近，而枇杷（拟南芥）的亲缘关系较远，这符合自然的进化规律。

由于鲨烯环氧酶在植物中存在的种类不多，且大多在药用植物中，特别是在人参属植物中，已发现并命名的基因至少有17个基因[10]。有一部分药用植物中的SE基因已经被克隆出来[5,7,11-17]，而桔梗中的三萜皂苷代谢通路的理论研究还不成熟。因此，在药用植物中分析SE基因可以为揭示三萜皂苷的代谢通路、利用植物基因工程技术人工合成三萜皂苷具有重要意义，也为下一步克隆这些基因提供生物信息学理论依据。

参考文献：

[1]郁梅,方彭华,于桂芳,等.桔梗的化学成分和抗肿瘤活性研究进展[J].国际药学研究杂志,2011,38(4)：280-283.

[2]李洁,高阳,刘云凤,等.不同树木落叶中三萜化合物的比较分析[J].河北林业科技,2011(2)：6-8.

[3]赵秀玲.桔梗的化学成分、药理作用及资源开发的研究进展[J].中国调味品,2012,37(2)：5-8,24.

[4]唐瑶,陈洋,曹婉鑫,等.三萜皂苷结构及应用的研究进展[J].安徽化工,2015,41(2)：13-22.

[5]蒋军富,李雄英,吴耀生,等.绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析[J].西北植物学报,2010,30(8)：1520-1526.

[6]付先军.中药归经（肺经）理论和肺系方剂配伍规律的解析及在海洋中药研发中的应用[J].中国海洋大学,2009,32(6)：1-249.

[7]牛云云,朱孝轩,罗红梅,等.三萜皂苷合成生物学元件的开发：三七鲨烯环氧酶编码基因克隆及表达模式分析[J]. 药学学报,2013,48(2)：211-218.

[8]李晶,林雄杰,何静敏,等.牛樟芝菌丝体和子实体三萜含量测定及Se和Mvd基因表达分析[J].西南农业学报,2016,29(9)：2206-2211.

[9]张艳敬,候志芳,梁韶,等.人参属药用植物三萜皂苷合成途径关键酶的研究进展[J].特产研究,2016,38(2)：53-57,70.

[10]金健,吴亚运,晏旋,等.人参属植物鲨烯环氧酶编码基因的生物信息学分析[J].公共卫生与预防医学,2016,27(3)：9-12.

[11]李惠华,徐剑,刘小英,等.鲨烯环氧酶基因(SQEs)的克隆及其在温度胁迫下与枇杷悬浮培养细胞中熊果酸(UA)含量的相关性[J].农业生物技术学报,2015,23(4)：481-491.

[12]邢朝斌,曹蕾,陈龙,等.刺五加鲨烯环氧酶基因cDNA的克隆及序列分析[J].中国中药杂志,2012,37(2)：172-175.

[13]牛云云.三七、西洋参中三萜皂苷合成关键酶基因的克隆及表达模式分析[D].北京：北京协和医学院中国医学科学院,2013：1-82.

[14]殷秀梅.蛇足石杉HsFPS1、HsSQS1和HsSE1基因克隆、生物信息学预及表达分析 [D].重庆：西南大学,2013：1-45.

[15]成慧,杨光,刘雅婧,等.龙牙楤木SE基因克隆与植物表达载体构建[J].吉林农业大学学报,2011,33(1)：47-50.

[16]SUZUKI H,ACHNINE L,XU R,et al.A genomics approach to the early stages of triterpene saponin biosynthesis in Medicago truncatula.Plant J,2002,32(6)：1033-1048.

[17]孙婷婷,邹莉,张林芳,等.桑黄鲨烯环氧酶基因克隆与序列分析[J].中草药,2015,46(18)：2768-2773.