安徽乌菜游离小孢子培养及植株再生体系建立

秦艳梅，王明霞，江海坤，严从生，王艳，田红梅，张其安，方凌

（安徽省农业科学院园艺研究所，合肥，230031）

●育种研究●

安徽乌菜游离小孢子培养及植株再生体系建立

秦艳梅，王明霞，江海坤，严从生，王艳，田红梅，张其安，方凌

（安徽省农业科学院园艺研究所，合肥，230031）

以6份安徽乌菜为试材，研究基因型、6-BA、AG对乌菜小孢子胚状体发生的影响及6-BA对植株再生的影响。试验结果表明，不同基因型乌菜的小孢子胚诱导率具有明显差异，6份乌菜材料中有3份诱导出胚状体，H-4出胚率最高，平均每花蕾诱导8.76个胚；NLN-13培养基中添加0.2 mg/L 6-BA和AG 10 mg/L均能促进胚状体发生，后者促进作用更明显；MS培养基中添加1 mg/L 6-BA可提高乌菜胚状体成苗率。

乌菜；小孢子培养；诱导率；胚状体；植株再生

安徽乌菜是安徽省名优特产，是十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，杂种优势明显，常规杂交法育种年限较长，结合现代生物技术进行乌菜育种对提高育种水平和效率至关重要。

游离小孢子培养是育种中最有效的生物技术之一，在大白菜、不结球白菜、菜薹等十字花科蔬菜作物上多有报道[1～4]，而对于乌菜的小孢子培养研究较少，存在胚状体诱导率低的问题。本试验选用6份不同基因型的安徽乌菜为试材，进行游离小孢子培养，探讨6-BA（6-苄氨基嘌呤）和AG（阿拉伯半乳聚糖）对乌菜游离小孢子培养胚状体诱导率的影响及6-BA对胚状体植株再生的影响，为建立优化乌菜游离小孢子培养技术体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用安徽地方乌菜材料6份，材料编号1403、1404、1408、1416、1418、H-4。

试验材料于2015年9月6日播种，10月4日定植，露地栽培，常规管理。2015年12月，每份材料选取10株移植到塑料大棚。2016年3～4月初花期至盛花期选取适宜大小的花蕾进行游离小孢子培养。

1.2 试验方法

①胚诱导培养 小孢子培养基本操作流程参照申书兴等[5]大白菜游离小孢子培养方法。在初花期至盛花期，于晴天8：00～10：00，选取健壮、大小适宜的花蕾（花瓣与花药长度比例1∶2～3∶4，多数小孢子处于单核靠边期），以主枝和一级侧枝上的花蕾为宜。放入25 mL无菌小烧杯中，首先用70%酒精消毒30 s，其次用2.5%NaClO溶液消毒5 min，然后用无菌水冲洗3次；加入B5无菌液体培养基，用玻璃棒轻轻挤压使小孢子游离出来，经350目滤网过滤，收集滤液于15 mL旋盖离心管中，于1 000 r/min离心3 min，弃上清，重复2次，得游离纯化的小孢子。

将分离纯化后的小孢子分别附加 0、0.2、0.4 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）或0、5、10、20 mg/L阿拉伯半乳聚糖（AG）的NLN-13培养基制成悬浮液，添加活性炭0.1 mg/mL，调整小孢子密度约1× 105个/L，分装于直径60 mm的无菌培养皿中，以Parafilm膜封口，每份材料取花蕾25个，分装于4皿培养，重复 3次。33℃黑暗热激培养24 h后，转入25℃黑暗条件下培养，有肉眼可见的胚出现时，转移到转速60 r/min的摇床上继续暗培养至形成子叶型胚状体，3周后统计胚状体数目。

②胚状体植株再生 利用附加浓度为0、1 mg/L 6-BA，10 g/L琼脂，30 g/L蔗糖的MS固体无菌培养基作为胚状体成苗培养基，将获得的乌菜成熟胚状体转接入成苗培养基中，3周后统计成苗率。

2 结果与分析

2.1 供体基因型的影响

在6份乌菜材料游离小孢子培养中，有3份诱导出胚状体（H-4、1404、1408），占参试材料的50%。其中H-4产胚能力较强，在添加10 mg/L AG的NLN-13培养基中，平均每花蕾可诱导8.76个胚；1408次之，平均每花蕾可诱导2.91个胚；1404平均每花蕾可诱导1.16个胚。而1403、1416、1418则没有胚状体产生。可见，不同基因型乌菜材料的小孢子培养胚状体诱导率存在差异。

2.2 6-BA对乌菜小孢子胚状体诱导的影响

在NLN-13诱导培养基中加入不同浓度的6-BA，胚状体诱导率统计结果见图1。对于能诱导出胚的3份材料，6-BA浓度对胚状体诱导率的影响均呈单峰变化，低浓度的6-BA对乌菜小孢子胚诱导有一定的促进作用。当6-BA浓度为0.2 mg/L时，胚诱导率达到最高，乌菜1404、1408、H-4平均每花蕾诱导胚状体数目依次为3.64、1.16、0.68个。

2.3 AG对胚状体诱导的影响

在NLN-13诱导培养基中加入不同浓度AG，25℃暗培养20 d，统计结果表明（图2），低浓度的AG对乌菜小孢子胚诱导有一定的促进作用，高浓度的AG则有抑制作用。当AG浓度为10 mg/L时，胚诱导率达到最高，3份供试乌菜的胚状体诱导率随浓度变化趋势表现一致。

2.4 6-BA对胚状体成苗的影响

选择成熟的乌菜胚状体转接入成苗培养基（图3），表1中结果表明，在MS培养基中加入1 mg/L 6-BA可提高乌菜试材1408和H-4的胚状体成苗率，且促进作用显著，但1404的胚状体并未形成双单倍体植株，说明在培养基中添加6-BA并不是对所有基因型的乌菜胚状体成苗具有促进作用。

3 结论与讨论

小孢子胚胎发生能力受基因调控。在白菜小孢子培养研究中发现，不同基因型间小孢子胚状体诱导率差异很大[1，6，7]。本试验中6份供试乌菜有 3份可诱导出胚状体，成功率为50%，不同基因型乌菜出胚率差异较大，与前人在其他作物上相关研究结果一致。

图1 NLN-13培养基中添加6-BA对乌菜小孢子胚状体诱导率的影响

图2 NLN-13培养基中添加AG对乌菜小孢子胚状体诱导率的影响

图3 乌菜小孢子培养胚状体及植株再生

适量的6-BA可显著提高白菜小孢子胚状体或愈伤组织诱导率[2～4]；蒋武生等[8]则认为加入 6-BA和NAA抑制大白菜小孢子胚发生。AG对小麦、大白菜和普通白菜小孢子培养胚发生和直接成苗有促进作用[9，10]。本试验结果表明，在NLN-13培养基中分别添加6-BA和AG可大大提高乌菜小孢子胚状体诱导率，促进小孢子细胞发育由配子体途径向孢子体途径转变。在一定程度上解决乌菜胚状体诱导率低的问题，但是本试验中6份供试材料仅3份诱导出胚，并不能解决所有乌菜难诱导出胚的问题，所以针对其他乌菜材料胚诱导条件以及胚胎发生机理还需要进一步试验摸索，以优化乌菜小孢子培养技术体系。

表1 6-BA对乌菜小孢子胚状体成苗的影响

本试验乌菜小孢子培养过程中，在MS培养基中附加1 mg/L 6-BA有促进乌菜1408和H-4的胚状体再生植株的作用，而1404胚状体则未形成植株，可能由试材1404的胚状体本身生活力弱和其对6-BA的应答反应不同2种原因共同导致。通过改变6-BA的浓度或加入一定浓度AG是否能进一步提高胚状体成苗率尚待研究。

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[3]姜凤英，冯辉，王超楠.小白菜小孢子培养胚状体的诱导[J].沈阳农业大学学报，2006，37（5）：763-765.

[4]吴艺飞，丁茁荑，肖杰，等.菜薹小孢子培养诱导胚状体的影响因素研究[J].湖南农业科学，2013（19）：16-19.

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[9]Letarte J,Simion E,Miner M,et al．Arabinogalactans and arabinogalactan-protein induce embryogenesis in wheat (Triticum aestivumL．)microspore culture [J].Plant Cell Rep,2006,24:691-698.

[10]王爱杰，章云，刘洋，等.AG和AGPs对大白菜和普通白菜（小白菜）小孢子胚状体诱导及成苗的影响[J].中国蔬菜，2012（4）：62-66.

Dissociative Microspore Culture of AnhuiPorphyra haitanensisand Establishment of Plant Regeneration System

QIN Yanmei,WANG Mingxia,JIANG Haikun,YAN Congsheng, WANG Yan,TIAN Hongmei,ZHANG Qi'an,FANG Ling
(Horticultural Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031)

The microspore embryogenic impact factors including genotypes,6-BA and AG the effect of 6-BA on plant regeneration were studied using the six AnhuiPorphyra haitanensiscultivars as the materials.The results showed that the frequency of microspore-induced embryos varied remarkably among the different genptyes cultivars,and embryos were included from three cultivars.H-4 had the highest induction rate with the frequency of 8.76 embryos per bud.Adding 0.2 mg/L 6-BA or 10 mg/L AG to NLN-13 medium could promote the embryos induction,and the latter was more obvious.1 mg/L 6-BA added to MS medium could improve the plant regeneration rate of AnhuiP.haitanensisembryos.

Porphyra haitanensis;Microspore culture;Inductivity;Embryoid;Plant regeneration

S634.4

A

1001-3547（2017）06-0029-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.06.012

安徽省农业科学院院长青年创新基金项目（15B0338）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（GARS-25-G-18）

秦艳梅（1987-），女，研究实习员，从事蔬菜育种工作，电话：15855132330

方凌，通讯作者，研究员，从事蔬菜品种选育及产业化研究

2016-12-13