滇重楼内生菌分离及其发酵液抑菌活性

施蕊++王娟+叶敏+赵能++夏箐++李彪

摘要：为研究滇重楼内生真菌的抑菌活性，先从滇重楼块茎中分离得到98株内生真菌，对峙试验结果表明，其中有8株内生真菌对供试植物病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有一定的抑制作用；内生真菌发酵液初提物抑菌试验结果表明，3株内生真菌发酵液的提取物对供试植物病原菌有一定的抑制作用，分别为PPC-25、PPC-43、PPC-78，其他菌株的发酵液提取物对供试植物病原菌没有抑菌活性。

关键词：滇重楼内生菌；分离；发酵液提取物；抑菌活性

中图分类号： S482.2+92文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）06-0086-02

滇重楼[Paris polyphylla Smith var. yunnansensis （Franch.） Hand]分布于云南省、贵州省和四川省，生长在海拔 1 400～3 100 m的常绿阔叶林、云南松林、竹林、灌丛或草坡内。滇重楼根茎入药，有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于疔肿痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等症状[1]。另外，滇重楼的次生代谢产物甾体皂苷有止血、祛痰、抑菌、镇静镇痛、抗早孕杀精子、抗细胞毒素等作用，临床上用于治疗功能性子宫出血、神经性皮炎、外科炎症以及肿瘤等，具有显著的疗效[2-6]。随着新药的研究开发，滇重楼成为著名中成药云南白药、宫血宁胶囊等产品的主要原料，制药工业需求量逐年递增，滇重楼供不应求[7]。由于滇重楼种子有“二次休眠”现象，种苗繁育存在巨大困难[8]。目前滇重楼的繁殖方法主要是根茎切块繁殖和组织培养等，但是在育苗过程中创口和组培苗容易受到病原菌侵染，导致滇重楼根腐病大面积发生，造成严重的经济损失。植物内生菌在植物抵御外来有害病菌入侵、促进种子萌发、促进植物生长和植物有效成分代谢等方面起着重要的作用[9-13]。但是，有关滇重楼内生真菌的研究不多。

因此，研究滇重楼内生真菌的抑菌活性，有利于提高植物的抗病性；同时，研究结果能为共生真菌与植物的共生关系提供科学依据，为滇重楼的人工栽培提供技术参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1滇重楼块茎来源滇重楼块茎于2014年采自云南省普洱市。

1.1.2培养基试验用培养基为PDA培养基。

1.1.3供试病原菌供试病原菌由云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室提供，供试病原菌株编号及名称见表1，采用的病原菌均为植物土传病害病菌。

1烟草黑胫病菌（Phytophtora parasitica var. nicotianae Tucker）

1.2试验方法

1.2.1滇重楼内生菌分离取健康滇重楼植株的根状茎，弃泥土，用水冲洗干净，晾干水分，按照以下步骤进行表面杀菌处理：0.2%氯化汞消毒10～30 s，无菌水冲洗，75%乙醇消毒 10～60 s，无菌水冲洗，处理完毕后在无菌条件下将滇重楼样品切成2 cm×2 cm的小块，种植于PDA培养基内，培养5～10 d，观察培养基中有无菌落形成，挑取菌落转接入PDA斜面培养基中，按常规微生物学法分离、纯化和保藏。

1.2.2对峙试验滇重楼内生真菌的抑菌活性测定采用平皿对峙培养法，各供试病原菌和滇重楼内生真菌置于28 ℃黑暗条件下培养3 d后，用打孔器（直径6 mm）沿其菌落边缘打菌饼，将内生真菌与病原菌菌饼接种于PDA平板上距中心 15 mm 处同一直线上的2点中，同时以只接病原菌和内生真菌的平板作为对照，每个处理重复3次，分别置于28 ℃恒温培养箱中黑暗条件下培养，每24 h观察1次，选择能够抑制供试植物病原菌菌丝生长的内生菌进行液体培养，准备其发酵代谢物的抑菌活性研究。

1.2.3发酵液中代谢物质的萃取将选择的有抑菌活性的内生菌接种于PDA液体培养基中，在28 ℃、220 r/min的摇床上培养7 d，待培养基中布满菌丝，停止培养，挑去菌丝，用等量乙酸乙酯萃取10 h，65 ℃减压蒸馏浓缩至2 mL，自然挥干称质量，加乙酸乙酯2 mL保存。

1.2.4萃取物抑菌试验利用1/10 000天平称量内生菌发酵液粗提物，用无菌水将各溶剂萃取物分别稀释成15、10、5 mg/mL 的溶液。配制马铃薯培养基，灭菌，备用。无菌条件下，将稀释的不同发酵液粗提物与马铃薯培养基在（40±5） ℃ 条件下以1 ∶9的比例混合，倒入培养皿，冷却制成有毒培养基平板后分别接入供试病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、烟草黑胫病菌菌饼（直径9 mm），每个浓度、每个菌种均设3皿重复。以不加提取物的马铃薯培养基为对照。观察菌落生长情况，在第7天测量菌落直径，抑菌率按照公式（1）进行计算：

抑菌率=对照病原菌菌落直径-处理组病原菌菌落直径1对照病原菌菌落直径×100%。（1）

1.2.5数据统计试验所得数据采用SPSS 17.0进行方差分析。

2结果与分析

2.1滇重楼内生真菌和对峙试验结果

从滇重楼植物中分离得到98株内生真菌，将这些内生真菌与供试植物病原菌进行对峙试验。由表2可见，滇重楼内生真菌PPC-78和PPC-43对供试植物土传病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有很强的抑制作用，其抑菌率均在82%以上，且PPC-78对尖孢镰刀菌的抑制率达到了100.00%；内生菌PPC-25的抑菌效果也很好，对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌的抑制率在58.83%～7281%之间；内生真菌PPC-03、PPC-21、PPC-32、PPC-71和PPC-73对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌也有不同程度的抑制效果。

2.2发酵液对立枯丝核菌的抑菌活性

采用对峙试验中能夠抑制病原真菌生长的菌株发酵液初提物对立枯丝核病菌进行抑制试验。

由表3可以看出，對峙试验有抑菌效果的8株滇重楼内生菌中，发酵液提取物对供试植物病原菌有抑菌作用的菌株仅有3株，它们分别是PPC-25、PPC-43和PPC-78，其他

内生菌发酵液提取物对供试病原菌没有抑制作用；PPC-25、PPC-43、PPC-78发酵液提取物对立枯丝核菌的抑菌率分别是9.76%、37.21%、67.44%，对尖孢镰刀菌的抑菌率分别是8.65%、62.55%、83.11%，对烟草黑胫病菌的抑菌率分别是5.07%、47.66%、77.49%。相比而言，PPC-78发酵液提取物的抑菌活性最强，PPC-43次之，PPC-25最弱。其他菌株的发酵液初提物对供试植物菌株没有抑制作用，但是活体对峙试验有抑制作用，可能的原因有2点：（1）营养竞争；（2）植物病原菌刺激内生真菌产生有抑菌活性的物质。

3结论与讨论

从滇重楼块茎中分离得到98株内生真菌，对峙试验结果表明，其中有8株内生真菌对供试植物病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有一定的抑制作用，菌株编号分别为PPC-03、PPC-21、PPC-25、PPC-32、PPC-43、PPC-71、PPC-73、PPC-78；内生真菌发酵液初提物抑菌试验表明，3株内生真菌发酵液的提取物对供试植物病原菌有一定的抑制作用，分别为PPC-25、PPC-43和PPC-78，其他菌株的发酵液提取物对供试植物病原菌没有抑制活性。

所用的植物病原菌仅包括土传病害菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌，不能断定除菌株PPC-03、PPC-21、PPC-25、PPC-32、PPC-43、PPC-71、PPC-73和PPC-78外的内生菌没有抑菌活性，应继续探索滇重楼内生真菌对其他病原菌的抑菌活性，包括植物病原菌和动物病原菌。

本研究仅对部分菌株的发酵液提取物抑菌活性进行研究，还应对其他菌株的发酵液提取物的抑菌活性进行研究；另外，本研究仅采用乙酸乙酯对发酵液中的物质进行初步提取。下一步研究将围绕内生真菌代谢产物的分离、结构鉴定等方面进行。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.022